Desde o início da engenharia genética, a inserção de genes exógenos em células hospedeiras apresentou desafios, seja pelo aumento do tamanho das inserções, seja pelo desafio de direcionamento preciso para integração em regiões do genoma permissivas para transcrição. Com o advento da Biologia Sintética, há um aumento da complexidade para a inserção, não apenas de um gene, mas de diversos genes componentes de vias metabólicas e circuitos genéticos, além da necessidade de estudos mais refinados de organização, estruturação e regulação genômica. A fim de evitar integração aleatória no genoma que possa gerar expressões instáveis ou fenótipos imprevisíveis, é demandado integração específica sem modificação da expressão de genes endógenos codificadores de proteínas essenciais. Uma abordagem comum é direcionar as inserções para regiões intragênicas ou intergênicas capazes de acomodar a expressão esperada do inserto sem alterações adversas ao hospedeiro, denominadas Porto Genômico seguro (do inglês, Genomic Safe Harbor, GSH). GSHs foram encontrados em humanos, camundongos, macacos e Cryptococcus, porém em sua maioria estão em regiões com alta densidade gênica e no caso de humanos próximos a genes relacionados ao câncer. Com o objetivo de expandir o número de GSHs disponíveis em diferentes organismos, a presente proposta visou o desenvolvimento de um programa de identificação de prováveis GSHs com uma abordagem otimizada seguindo critérios definidos para refinar a busca por novas regiões extragênicas de inserção em três organismos eucarióticos: humano, camundongo e Saccharomyces cerevisiae. Esse programa, SHIP (do inglês, Safe Harbor Identification Program), foi desenvolvido na linguagem Python e utilizou como entrada arquivos de anotação gênica do organismo estudado aliado a informações de características regulatórias de expressão gênica, como potencial de metilação do DNA, locais de ligação de fator de transcrição e sítios de alterações de histonas, identificando 6 pGSHs em Saccharomyces cerevisiae, 16 em Homo sapiens e 11 em Mus musculus. Adicionalmente, essa proposta validou in vivo 5 GSHs identificados pelo programa SHIP no organismo modelo S. cerevisiae. Desta maneira, o programa SHIP é o primeiro algoritmo, disponível e validado experimentalmente, userfriendly e capaz de identificar pGSHs em qualquer organismo Eucarioto com anotação genômica.

O mecanismo catalítico das serino proteases, o grupo mais abundante de enzimas proteolíticas, baseia-se em três componentes estruturais: a tríade catalítica, o oxyanion hole e os bolsões de especificidade. Os resíduos da tríade catalítica (serina, histidina e aspartato) estão dispostos de quatro formas diferentes na sequência polipeptídica dos clãs clássicos de serino proteases, indicando pelo menos quatro origens evolutivas diferentes desta maquinaria e permitindo a separação destas enzimas de acordo com a disposição da tríade. No entanto, em teoria, os resíduos da tríade podem ser dispostos em seis ordens diferentes. A razão pela qual as outras duas disposições possíveis não estão presentes nas serino proteases conhecidas ainda não foi descoberta. Assim, para investigar este fenômeno, o objetivo deste trabalho é encontrar e/ou construir serino proteases que possuam novas tríades catalíticas. As estruturas depositadas no Protein Data Bank e no AlphaFold Protein Database foram analisadas por um algoritmo que mediu as distâncias entre átomos específicos de todos os resíduos de serina, histidina e aspartato ao longo da estrutura da proteína e comparou os resultados com o valor de distância de corte calculado a partir das distâncias médias encontradas nos sítios ativos de serino proteases conhecidas. As tríades que satisfaziam este critério foram separadas de acordo com a ordem em que os três resíduos aparecem na sequência da proteína. Algumas dessas tríades tinham as duas disposições que não se encontram nas serino proteases, então sua área de superfície acessível foi comparada com o padrão encontrado nos resíduos catalíticos das serino proteases. A única tríade que satisfazia este critério era acessível ao solvente, mas distante da superfície e, por conseguinte, inacessível aos peptídeos. Construir um modelo de uma serino protease com uma tríade não documentada utilizando esta proteína implicaria a remoção de parte desta proteína para que o substrato pudesse alcançar a tríade e, em seguida, incluir um oxyanion hole e resíduos de ligação ao substrato, levando ao descarte desta proteína como modelo.

A produção de café é altamente afetada por patógenos, inclusive nematoides como Meloidogine incognita. Embora existam acessos de Coffea arabica resistentes a esse importante nematoide das galhas (RKN, do inglês 'root-knot nematode'), a resposta imunológica em níveis moleculares ainda não é elucidada em detalhes. Para isso foi gerado um transcritoma de raízes de cafeeiro resistente ao M. incognita (acesso UFV 408-28), aos seis dias após a inoculação de RKN. Dentre os genes diferencialmente expressos (DEGs) nesse transcritoma, trinta e duas sequências foram preditas na anotação automática como inibidores de endopeptidases, tipo miraculina, apresentaram transcritos abundantes. As análises de enriquecimento por gene ontology mostraram que o grupo dos inibidores de endopeptidases, onde se classificam as miraculinas, apresentam uma supere-expressão quando C. arabica é desafiado com RKN. As análises pelo MapMan mostraram uma forte alteração na regulação de genes referentes à parede celular e de genes relacionados a patógenos (PR), grupo onde as miraculinas foram incluídas. A análise de homologia das sequências de miraculinas comparadas a sequências de referência mostraram que sete das trinta e duas iniciais eram de fato miraculinas. Por fim a validação desses genes por RT-qPCR confirmou a alteração de expressão desses genes na interação planta-patógeno. As informações do presente trabalho servem como substrato para programas de melhoramento genético e ainda para iniciar a elucidação do papel das miraculinas nessa interação.

O Câncer de mama é uma doença heterogênea com diferentes perfis moleculares, apresentando metástases em órgãos como pulmões e ossos. As metástases são responsáveis pela redução da qualidade de vida, maior necessidade de atendimento hospitalar e é a principal causa de morte. A terapia convencional utiliza de estratégias medicamentosas associadas à cirurgia e radioterapia, o principal objetivo é o combate às células cancerosas e a redução da inflamação provocada pelo tratamento. A terapia adjuvante que é utilizada para controle do processo inflamatório promove a perda óssea, impactando na progressão tumoral, uma vez que o tecido ósseo é reservatório de fatores de crescimento e moléculas importantes para o estabelecimento de células cancerosas em sítios metastáticos. A fim de minimizar efeitos adversos em órgãos livres de tumor e assim prevenir o surgimento de metástases ósseas, a nanobiotecnologia é empregada através da utilização de nanopartículas lipídicas sólidas contendo doxorrubicina. O tratamento nanoestruturado apresentou prevenção da perda óssea em estudos prévios e está sendo estudado sobre sua capacidade de modular a diferenciação de células do tecido ósseo assim como prevenir a redução da densidade mineral óssea em modelo experimental de câncer de mama em camundongos.

A capacidade de regular a expressão de genes em resposta a sinais externos é um dos mecanismos centrais envolvidos na manutenção da vida na natureza, sendo também um dos principais objetivos de cientistas no esforço para controlar e reprogramar organismos. Para tal, ferramentas moleculares que permitam a manipulação gênica são cruciais na biologia sintética, especialmente na criação de circuitos genéticos complexos e redes regulatórias sintéticas. Serinaintegrases (Ints) são importantes candidatos devido a suas propriedades, principalmente ortogonalidade e a capacidade de executar suas funções sem necessidade de cofatores. Além disso, a edição realizada pode resultar em diferentes tipos de rearranjos, como inserção, excisão ou inversão. Considerando as vantagens advindas de sua plasticidade de uso e robustez, neste trabalho apresentamos a aplicação de Ints na construção de circuitos genéticos integrados aos genomas de dois modelos de graus de complexidade distintos: Mycoplasma mycoides JCVI-Syn3B, uma bactéria de genoma procariótico minimizado sinteticamente, e Nicotiana benthamiana, um importante modelo vegetal com genoma eucariótico complexo. Em M. mycoides JCVI-Syn3B, Int9 e Int13 foram inicialmente avaliadas como efetores de interruptores genéticos capazes de inverter a sequência codificadora de um gene repórter. Apenas a ativação por Int9 resultou no aumento de expressão do repórter, sendo então selecionada como ativador para um segundo interruptor aplicado na regulação de expressão da endonuclease I-CeuI, usada na digestão e consequente perda do genoma celular para produção de Simple Cells (SimCells), uma importante plataforma para aplicações em biologia sintética. O uso do interruptor controlado por Int9 permitiu um fino controle de expressão da nuclease, sem observação de morte das culturas na ausência de ativação da integrase. Por fim, visando a elaboração de um sistema para a seleção negativa de escapes do processo de remoção do genoma, promotores induzíveis foram testados, com apenas o promotor pA13/AraEAraR apresentando o comportamento esperado, porém com níveis de expressão muito baixos. Já para N. benthamiana um sistema mais complexo foi desenhado. Nomeado Int-Plex@ (Integrase- Plant Expression), o sistema consiste em um gene repórter flanqueado por sítios att das integrases BxB1, phiC31, Int9 e Int13, podendo ser dividido em dois módulos: inversão e excisão. O primeiro módulo é composto pelos sítios att de Int9 e Int13, com sua recombinação resultando em uma inversão do DNA alvo e expressão de mGFP. A ativação com as duas Ints resultará no retorno do gene repórter à sua orientação inicial. Já o módulo de excisão é ativado por BxB1 ou phiC31. Sua ativação leva à remoção irreversível da sequência de DNA flanqueada por seus sítios att. As integrases foram entregues por meio de agroinfiltração e todas as integrases testadas foram capazes de editar o genoma de N. benthamiana. O sistema Int-Plex@ poderá futuramente ser adaptado para editar e modular vias metabólicas vegetais de interesse econômico ou ambiental, endereçando questões de biocontenção de transgenes, dada a possibilidade de excisão da construção. Somando aos esforços de avanço em biologia sintética, o trabalho incluiu a implementação de metodologias de produção e uso de sistema de expressão in vitro (TxTl) e encapsulamento para geração de sistemas sintéticos, incluindo a comprovação de funcionamento do sistema Int-Plex@ no sistema TxTl.

A atual preocupação por processos mais ecologicamente sustentáveis levaram a uma demanda de estudos de valorização de uma matéria que, comumente, tem seu potencial desperdiçado, no caso a lignina presente na biomassa vegetal. A recalcitrância enzimática causada pela estrutura complexa e amorfa acaba sendo uma das etapas limitantes no processo de valorização da lignina e por isso normalmente esse composto é queimado para geração de energia nas próprias indústrias. Apesar disso, microrganismos como os fungos e bactérias são conhecidos por conseguirem contornar essa recalcitrância por meio das suas enzimas. A desconstrução da lignina por bactérias é um ramo recente nas pesquisas e representam diversas vantagens frente aos fungos. Nesse estudo, foi analisada a diversidade microbiana de três consórcios enriquecidos para microrganismos capazes de degradar lignina com foco nas bactérias. Os consórcios foram obtidos a partir de três tipos de solo, sendo dois comerciais e um solo de compostagem jardim, cultivados a 30˚C e enriquecidos por meio de sucessivas passagens em meio de cultura na qual a lignina extraída por método alcalino foi usada como única fonte de carbono. Foi extraído o DNA metagenômico da terceira passagem do enriquecimento, sendo feito o sequenciamento pelo Joint Genome Institute, gerando 232 genomas montados, destacando-se 39 genomas após critérios de qualidade de completude de pelo menos 70% e contaminação menor ou igual a 10%. Desses 39 genomas, os filos mais abundantes nos três consórcios foram de proteobacteria, bacteroidetes e actinobacteria, com somente dois genomas com taxonomia superior de espécie. Os consórcios apresentaram funções condizentes com o local de isolamento, no caso o solo, além de possíveis metabolismos relacionados à degradação da lignina. Foram escolhidos 4 genomas, com base na taxonomia somente, por terem chegado apenas em nível de classe, para análises mais profundas de degradação de lignina focada nos monolignóis. Os genomas de Actinobacteria BY 70_11 e Actinobacteria BY 2_71_9 e Alphaproteobacteria MG 62_16 e Alphaproteobacteria MG 3_66_13, além de não representarem a mesma espécie, mostraram diferentes vias metabólicas relacionadas à degradação dos monolignóis. Desses, a Actinobacteria BY 70_11 com a maior quantidade de genes associados à degradação de lignina. Entretanto, não se pode afirmar inequivocamente sobre a capacidade ou não de degradação da lignina codificada nesses 4 genomas pela falta de literatura sobre essas vias específicas. Esse trabalho mostrou-se como uma etapa inicial para que outros sejam realizados sobre a degradação da lignina com os mesmos genomas com o ampliamento de vias metabólicas e com mais genomas para análises mais profundas do metabolismo de lignina.

A Colite Ulcerativa se destaca como uma das doenças inflamatórias intestinais de caráter crônico onde a inflamação pode se estender do reto até o cólon. Atualmente não existe cura para a colite e os tratamentos são focados em melhorar a qualidade de vida dos pacientes reduzindo sintomas, tratamentos que utilizam anticorpos monoclonais se mostram mais eficientes em pacientes acometidos do que tratamentos focados em Ácido Aminossalicílico combinados com Corticosteroides. Porém, o custo de produção e purificação de anticorpos monoclonais é alto o que dificulta a distribuição deste tipo de medicamento de forma ampla a população. Probióticos além de serem capazes de auxiliar no restauro da microbiota normal saudável também tem mostrado significativo avanço na expressão de proteínas recombinantes. A Saccharomyces boulardii é uma levedura probiótica utilizada para auxiliar no tratamento de doenças intestinais e propomos nesse trabalho utiliza-la como modelo de entrega de terapias orais. Como modelo de anticorpo terapêutico propomos o uso de um anticorpo anti-CD3, que pode, em tese, produzir resposta local anti-inflamatória para o tratamento de Colite Ulcerativa. Para testar a produção de fragmentos de anticorpos em S. boulardii, produzimos um vetor de expressão contendo um scFv anti-CD3 fusionado ao gene SED1, proteína nativa de parede celular. A expressão do scFv associado a parede do fungo foi avaliado por Imunodetecção com foco na fração celular insolúvel apresentando presença da proteína recombinante. A linhagem transformante S. boulardii produtora de scFv anti-CD3 foi administrada via oral em camundongos com colite induzida por dextrana sulfato de sódio, e houve melhora no índice de atividade da doença e mudança positiva no perfil da microbiota fecal quando comparado ao grupo que não recebeu tratamento.

Os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa n-3 (n-3 PUFAs), como o ácido docosahexaenóico (DHA), possuem mecanismos protetores contra o estabelecimento de doenças inflamatórias, como a obesidade e o câncer. O DHA não só tem efeitos importantes sobre os tecidos adiposos, mas também tem a capacidade de induzir a morte celular por piroptose em alguns tipos de células tumorais. No entanto, o papel dos n-3 PUFAS na comunicação entre o câncer de melanoma e os tecidos adiposos ainda é pouco conhecido. Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar o papel do ômega-3 na modulação dostecidos adiposos e sua função sobre os parâmetros carcinogênicos do melanoma, especialmente, na indução de morte celular por piroptose. Camundongos (C57/BL6) foram suplementados ou não com ômega-3 enriquecido em DHA na concentração de 1g/kg por 30 dias. Após esse período, foram analisados soro, lavado peritoneal, tecidos adiposos, fígado e baço. Além disso, os produtos de secreção do tecido adiposo desses camundongos, suplementados com ômega-3, foram isolados e usados para estimular a linhagem celular de melanoma B16F10 in vitro. Parâmetros carcinogênicos como viabilidade celular, morte celular e quantificação de citocinas foram avaliados. Além disso, a linhagem celular de melanoma humano MeWo foi estimulada com DHA (12,5µM, 25µM, 50µM e 100µM) por 48h in vitro. A secreção de lactato desidrogenase (LDH), ativação da caspase-1 e perda da integridade da membrana plasmática foram analisados. Nossos dados demonstraram que a suplementação com ômega-3 enriquecido em DHA reduziu o peso dos tecidos adiposos. As células do lavado peritoneal dos animais suplementados aumentaram a biogênese de corpúsculos lipídicos, mas reduziram a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). Além disso, o estímulo da B16F10 com os produtos de secreção de tecido adiposo marrom (BAT) de animais suplementados levou a uma diminuição na viabilidade celular, bem como um aumento da morte celular e redução da secreção da citocina IL-6 de células de melanoma. Ademais, a concentração de 25µM de DHA induziu a liberação de LDH, aumentou a capitação de Iodeto de Propídeo e induziu ativação de caspase-1, marcadores característicos da morte celular por piroptose. Portanto, este trabalho demonstrou o potencial da suplementação com ômega-3 em modular o perfil e a função imunológica dos tecidos adiposos, assim como sugere a capacidade do DHA em induzir piroptose na em células de melanoma in vitro. Gerando, portanto, novas perspectivas para a utilização do ômega-3 DHA como adjuvante no tratamento do melanoma.

O uso de cogumelos com agentes benéficos à saúde remonta a milhares de anos, especialmente na cultura asiática. A prospecção do uso de polissacarídeos, investigados como potenciais mediadores de diferentes respostas imunológicas associadas a sistemas de inflamação e infecção tem sido foco de pesquisa nos últimos anos. Estudos recentes demonstram que o basidiomiceto Auricularia auricula, considerado o terceiro cogumelo comestível de maior importância cultivado no mundo, é utilizado não só no contexto alimentício, como alimentos funcionais, mas também apresenta valor para a indústria farmacêutica por seus compostos bioativos, como os polissacarídeos, vitaminas, proteínas, polifenóis e minerais. Polissacarídeos obtidos deste cogumelo apresentam atividade antioxidante, antitumoral, anticoagulante, hipoglicêmica, radioprotetora, antiviral e imunomodulatória. A modulação da resposta imune por polissacarídeos é bem descrita na literatura, com a atuação de receptores celulares responsáveis pela ligação de açúcares que levam a ativação e sinalização celular, desencadeando ativando resposta imune inata e adaptativa. A característica da resposta, entretanto, está associada com a composição molecular e estrutural destas moléculas, podendo variar com a composição monossacarídica, padrão de ramificação, peso molecular, solubilidade, método de extração da molécula e o grau de pureza obtido. Um dos polissacarídeos caracterizados como imuno estimuladores, são as β-glucanas, que foram avaliadas em aproximadamente $ 480 milhões no mercado global em 2020. Suas aplicações no mercado abrangem seu potencial imunomodulador e sua característica de alimento funcional. Polissacarídeos e oligossacarídeos adquiriram um espaço dentro do conceito de prebiótico, por serem fibras não digestíveis que podem ser benéficas ao hospedeiro ao, seletivamente, estimular o crescimento e/ou atividade de populações da microbiota no cólon. Essa modulação da microbiota está associada a alteração na função da resposta imune e a melhora da integridade do microbioma intestinal. Quando esse microbioma é perturbado, pode ocasionar uma disbiose intestinal que pode progredir para uma resposta imune crônica tecidual. Localmente, a mudança de população leva a produção de metabólitos que interfere na homeostase tecidual para um quadro de dano ao hospedeiro, chamado de colite ulcerosa. Dados anteriores do grupo de pesquisa indicam que polissacarídeos obtidos do cultivo submerso deste cogumelo atuam na indução de uma resposta imune protetora na infecção pulmonar pelo fungo Cryptococcus neoformans. Nesse contexto, um dos objetivos deste trabalho foi avaliar como a administração de exopolissacarídeos obtidos do macrofungo Auricularia auricula por gavagem em camundongos c57BL/6, de linhagem selvagem e Knock-out para o receptor Dectina-1, atuaria em uma modelo experimental de colite, induzida por dextran sulfato de sódio (DSS). Os resultados indicam que o tratamento alterou os sintomas clínicos da colite e que a resposta seria dependente do receptor Dectina-1. Também propomos uma metodologia alternativa de extração para aumentar o rendimento de polissacarídeos do micélio e conferimos sua atividade biológica in vitro e in vivo, em um modelo experimental de infecção por Cryptococcus neoformans. Os resultados de caracterização molecular indicam que associado ao aumento do rendimento, obtivemos um heteropolímero capaz de ativar a produção de citocinas in vitro, mas que não controlou a evolução da infecção fúngica.

A doença de Chagas (DC) representa um grave desafio de saúde pública, principalmente em regiões endêmicas da América Latina e outras áreas afetadas. Esta doença, causada pelo parasito Trypanosoma cruzi, é transmitida principalmente por insetos vetores popularmente conhecidos como barbeiros, mas também pode ocorrer por via oral, transfusões sanguíneas, transplante de órgão e transmissão congênita. A DC é caracterizada por uma fase aguda, que pode ser assintomática ou apresentar sintomas leves e inespecíficos, seguida de uma fase crônica, que afeta principalmente o coração e o sistema digestivo. O tratamento eficaz para a doença de Chagas é um desafio, já que as opções disponíveis são limitadas e frequentemente associadas a efeitos colaterais. Além disso, o diagnóstico precoce é fundamental, pois muitos pacientes não apresentam sintomas na fase inicial. A falta de tratamentos eficazes e a necessidade de prevenção têm estimulado esforços para o desenvolvimento de vacinas capazes de proteger contra o parasito. Neste estudo, concentramos nossos esforços na investigação de duas proteases do T. cruzi, Prolyl Oligopeptidase (POPTc80) e Thimet Oligopeptidase (TOP), que desempenham um papel no ciclo de vida do parasito e representam alvos potenciais para vacinas. Exploramos três abordagens distintas para o desenvolvimento dos protótipos vacinais: proteínas recombinantes, vacinas de DNA e vacinas de mRNA. As proteínas recombinantes foram produzidas em Escherichia coli, e desenvolvemos um vetor otimizado para a produção de mRNA, que se mostrou eficaz na expressão de antígenos em camundongos. Além disso, avaliamos diferentes vias de inoculação, destacando a via intramuscular como a mais adequada devido à sua capacidade de manter a expressão do antígeno por um período prolongado. No entanto, nossos esforços para desenvolver formulações de imunização oral com alginato de sódio não obtiveram sucesso, destacando os desafios específicos associados a essa via de administração. Em resumo, a DC é uma enfermidade desafiadora que carece de tratamentos eficazes e diagnóstico precoce. Nossos esforços de pesquisa buscam abordagens inovadoras para o desenvolvimento de vacinas visando prevenir a infecção por Trypanosoma cruzi. A compreensão dos mecanismos de resposta imune desencadeados pelas proteases estudadas é essencial para avançar em direção a vacinas mais eficazes contra essa doença negligenciada.

A fim de controlar a prodridão negra das brássicas causada por Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), ferramentas biotecnológicas e nanotecnológicas foram utilizadas neste estudo. Na primeira etapa deste estudo, metabólitos concentrados extraídos de Rhizobium tropici (MC-RT) foram utilizados na indução de genes relacionados com defesa. Plantas de repolho foram cultivadas em casa de vegetação e aos 21 dias após a semeadura foram pulverizadas com solução de MC-RT a 1% nas folhas ou na raiz. As partes aérea e radicular foram coletadas separadamente no dia 0 (condição controle), 24 e 48 h após o tratamento (hat) e submetidas à extração de RNA para análise por RT-qPCR de 8 genesrelacionados com defesa. Os resultados mostraram que MC-RT aplicado nas folhas tem efeito protetor mais duradouro e sistêmico na planta. Os resultados obtidos neste estudo enfatizam o potencial biotecnológico do uso de MC-RT atuando como um elicitor de respostas de defesa ativas em plantas, podendo contribuir expresivamente para o controle da podridão negra das brássicas. Na segunda etapa deste estudo foi realizada a síntese verde de nanopartículas de prata (AgNPs) utilizando extratos aquosos de folhas de repolho, Arabidopsis, neem e noni, além de extratos aquosos de partes do fruto de noni (casca ou polpa/semente), como agentes redutores e estabilizantes. As reações de síntese de AgNPs foram realizadas em 6 diferentes concentrações de extratos em soluções aquosas de nitrato de prata (AgNO3), a 1 mM final, totalizando 42 amostras, das quais 14 amostras de AgNPs foram selecionadas, de acordo com seu diâmetro hidrodinâmico (DH), índice de polidispersidade (PdI) e potencial Zeta (ZP) e então testadas in vitro para avaliar suas atividades antibacterianas contra Xcc. As AgNPs que apresentaram a maior atividade antibacteriana na concentração de 64 µM, apresentaram o menor DH, como as sintetizadas com extrato aquoso da casca do fruto de noni (EACFN) na concentração de 60 mg/mL. Além disso, plantas com genótipos suscetíveis de B. oleracea foram tratadas com EACFN-AgNPs, e a modulação positiva de genes biomarcadores relacionados à defesa foi obtida por qRT-PCR. Plantas tratadas com EACFN-AgNPs a 64 µM quando desafiadas com Xcc apresentaram um fenótipo mais tolerante, destacando-se que a aplicação de AgNPs parece desencadear uma resposta efetiva de defesa da planta. O presente estudo revela o potencial das AgNPs em direcionar a atividade antibacteriana e melhorar a defesa das culturas de plantas e, finalmente, propõe uma abordagem alternativa interessante para combater a podridão negra, potencialmente extensível a outros patossistemas. Na terceira etapa deste estudo foi realizada uma análise proteômica para compreender os mecanismos de ação de AgNPs em Xcc tratada com AgNPs (32 µM), AgNO3 (32 µM), ou sem tratamento (condição controle). Posteriormente foi realizada a extração de proteínas totais e as amostras foram submetidas à análise proteômica. Foram identificadas 352 proteínas diferencialmente abundantes. Nas amostras tratadas com AgNPs, 134 proteínas foram diferencialmente abundantes, incluindo 107 proteínas aumentadas e 27 diminuídas, nas amostras tratadas com AgNO3 foram 14 proteínas diferencialmente abundantes, incluindo 10 proteínas aumentadas e 4 proteínas diminuídas, quando comparadas com a condição controle. Por fim, quando as amostras tratadas com AgNPs foram comparadas com as amostras tratadas com AgNO3, os resultados mostraram 204 proteínas diferencialmente abundantes, incluindo 75 proteínas aumentadas e 129 proteínas diminuídas. A análise de ontologia gênica mostrou que a maioria das proteínas reguladas positivamente estavam envolvidas em importantes processos biológicos, como homeostase de íons metálicos, desintoxicação, organização de membrana, processo metabólico de aminoácidos e carboidratos, processo metabólico lipídico, proteólise, transporte transmembranar e outros. Os resultados obtidos trazem importantes contribuições para a melhor compreensão dos mecanismos de ação de AgNPs em Xcc e poderão contribuir para o desenvolvimento de estratégias de controle de Xcc em brássica.

Theobroma grandiflorum é uma fruteira nativa da região amazônica e parente do cacau (T. cacao). Possui um enorme potencial econômico devido aos seus múltiplos usos nas indústrias alimentícia e cosmética. A cultura do cupuaçu é gravemente afetada pelo Moniliophthora perniciosa, fungo causador da vassoura de bruxa (VB), tanto no cupuaçu quanto no cacau. O conhecimento desse fitopatossistema é fundamental para propor estratégias de controle e mitigação dos danos causados pela VB a essas culturas. Para fornecer informações sobre a resistência do cupuaçu a M. perniciosa, os perfis transcritômicos de um genótipo resistente (clone 174) e um suscetível (clone 1074) foram analisados usando a tecnologia RNA-seq. Neste estudo, apresentamos a análise do transcritoma de ambos os genótipos desafiados com M. perniciosa, em diferentes tempos de exposição ao patógeno, na fase inicial da infecção. Um total de 21.441 unigenes e 440 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados entre as diferentes condições. A análise de diferença intrínseca entre os genótipos mostrou 301 DEGs. A alteração da expressão gênica foi observada mais precocemente no genótipo suscetível 24 horas após a inoculação (hai). No resistente, a alteração foi mais acentuada aos 48 hai. Este conjunto de dados permitiu a identificação de genes potencialmente envolvidos no mecanismo de defesa, entre eles, receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), fatores de transcrição, proteínas relacionadas à patogênese (PRs), proteínas relacionadas ao remodelamento da parede celular, genes relacionados ao acúmulo espécies reativas de oxigênio (ROS) acúmulo e vias de terpenos. A análise da assinatura dos fitohormônios em cada condição revelou uma influência hormonal significativa nas respostas dos genótipos. O genótipo diferiu principalmente em relação às respostas de auxina, citocinina, ácido salicílico e brassinosteróides. Este é o primeiro estudo de transcriptoma em larga escala de T. grandiflorum, que além de insights sobre o processo de resistência, gerou uma lista de genes potencialmente importantes neste processo. Três genes desta lista foram selecionados para avaliação funcional por expressão heteróloga em tomate Micro-Tom (MT): a) TgERF9 que codifica para um fator de transcrição, b) TgLPL1 que codifica para uma proteína semelhante a taumatina e 3) TgPR10.1. As plantas transformadas, expressando o gene de interesse, foram desafiadas com fungos fitopatogênicos hemibiotróficos (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raça 3 e Verticillium dahliae raça 2) e um fungo necrotrófico (Sclerotinia sclerotiorum). As plantas MT_TgERF9 e MT_TgPR10.1 foram desafiadas com M. perniciosa. Além disso, foi realizado um estudo da localização de transcritos de TgPR10.1 nos tecidos da gema apical de cupuaçuzeiro, via hibridização in situ (ISH). Todos os patógenos foram capazes de colonizar os tecidos das plantas transformadas e não transformadas. Contudo, apesar de ser visível o escurecimento interno do caule nas plantas inoculadas com verticillium e fusarium, não foram observados sintomas de murcha, mesmo em situação de déficit hídrico. Além disso, o crescimento das plantas e a produção de frutos não foram alterados em função da infecção. No entanto, as plantas transformadas com TgERF9 e TgTLP1 apresentaram uma tendência a serem menores e menos produtivas. Os bioensaios com folhas destacadas indicam que a expressão de TgTLP1 aumentou a suscetibilidade de MT ao fungo S. sclerotiorum. Plantas MT_TgPR10.1 apresentaram resistência moderada a S. sclerotiorum. A expressão deste gene em MT não afetou o desenvolvimento da VB. Entretanto, MT_TgPR10.1 apresentou alteração na altura, indicando alteração de balanço hormonal. No que se refere a localização dos transcritos de TgPR10.1 em cupuaçu, foi possível identificar expressão deste gene nos tricomas, no procâmbio, no meristema e nas células da epiderme dos primórdios foliares. A presença destes transcritos, particularmente no procâmbio, indica um papel desta PR no desenvolvimento e crescimento da planta, o qual é afetado por citocininas, fitohormônios reguladores centrais da atividade cambial. Considerando-se que no desenvolvimento da VB, a hiperplasia e hipertrofia de tecidos são sintomas típicos da doença, o envolvimento deste gene no processo pode ser relevante. O banco de dados gerados pelo sequenciamento, insights gerados sobre os mecanismos de defesa nos estágios iniciais da interação Cupuaçu- M. perniciosa, e estudo de função de genes envolvidos nesses mecanismos podem ser um recurso valioso para análises mais profundas, fornecendo maiores esclarecimentos sobre os mecanismos envolvidos na resistência e suscetibilidade em cupuaçuzeiros, subsidiando o desenvolvimento de seus programas de melhoramento e de estratégias de controle de VB

MicroRNAs endógenos (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão gênica a nível pós-transcricional por clivagem ou repressão da tradução de um mRNA. Os miRNAs em plantas regulam diversos processos celulares, incluindo respostas de defesa a estresses bióticos. A bananeira (Musa spp.), é uma cultura monocotiledônea cultivada principalmente nas regiões tropicais, é suscetível a inúmeras doenças devido a sua esterilidade e a baixa variabilidade genética. Pseudocercospora musae, é o agente etiológico da Sigatoka, caracterizada por manchas foliares, é um importante fungo patogênico da bananeira, causando perdas devido à redução da área foliar. As amostras de RNA de folhas foram extraídas de Musa acuminata subsp. burmannicoides, var. Calcutá 4 (resistente), aos 3 e 12 dias após a inoculação (DAI) com conidiósporos. Após a construção de uma pequena biblioteca de RNA, as amostras foram sequenciadas usando a tecnologia lllumina HiSeq 2500. As sequências de alta qualidade foram mapeadas contra M. acuminata ssp. malaccensis var. Pahang. O genoma de referência de Pahang e os miRNAs de plantas foram preditos usando os programas Mireap e ShortStack. Um total de 228 miRNAs conservados pertencentes a 30 famílias de miR foram identificados, juntamente com 22 novos miRNAs preditos. Em 3DAI, 48 miRNAs de 25 famílias de miR mais dois novos miRNAs foram significativamente diferencialmente expressos entre as amostras inoculadas e de controle. Em 12DAI, 31 miRNAs de 18 famílias de miR diferentes e dois novos miRNAs foram regulados após a inoculação. Os potenciais genes alvos do hospedeiro de miRNAs foram preditos usando TargetFinder. A caracterização de miRNAs em M. acuminata e seu papel na modulação da expressão gênica durante a interação com P. musae fornece recursos para o desenvolvimento de métodos eficientes de controle da Sigatoka Amarela.

A levedura Komagataella phaffii (Pichia pastoris) tem sido utilizada como uma plataforma de produção de proteínas heterólogas há mais de 20 anos por apresentar níveis elevados de expressão gênica pelo uso do promotor do gene AOX1 (PAOX1) induzido por metanol, dentre outras vantagens. Entretanto, o metanol, indutor químico, é tóxico e inflamável. Nos últimos anos, a optogenética tornou-se uma ferramenta muito utilizada para a regulação de processos biológicos, como: expressão gênica, localização de proteínas, transdução de sinais e interações proteína-proteína. Baseia-se na utilização da luz, um indutor físico, para o desenvolvimento de sistemas reguláveis. A aplicação de um circuito optogenético em K. phaffii para a regulação da expressão gênica permite utilizar um sistema induzido que não afeta o metabolismo da levedura e nem sofre interferência do metabolismo celular. No presente projeto, buscamos pela primeira vez o desenvolvimento de um circuito optogenético em leveduras. Esse sistema foi baseado na interação responsiva à luz de proteínas de fusão que se ligam ao promotor PAOX1. O sistema optogenético foi construído com sucesso requerendo, todavia, ajustes metodológicos para sua implementação. Outro sistema de regulação estudado neste trabalho foi baseado no uso de integrases, uma classe de proteínas virais que mediam a integração e a excisão dos fagos no genoma. Recentemente, foram caracterizadas 11 integrases ortogonais e não há relatos de sua utilização na construção de circuitos na levedura Saccharomyces cerevisiae até o momento. Esta levedura é reconhecida como modelo para o estudo da biologia dos organismos eucariotos, sendo um dos microrganismos mais estudados e caracterizados. Foi avaliada a integrase 13, junto com a integrase 4 sob o controle do promotor responsivo a galactose. Estas integrases apresentaram a capacidade de ativar o dispositivo genético abrindo caminho para sua utilização como novas ferramentas moleculares para o desenvolvimento e construção de circuitos sintéticos. Por último, foi combinado o sistema de regulação com as integrases com o sistema optogenético com o objetivo de ter um sistema duplamente regulado. O sistema final obtido apresentou-se funcional necessitando ainda ajustes nas condições de exposição à luz vermelha/escuridão.

O ácido lático é classificado como um químico plataforma devido às numerosas aplicações a que pode ser destinado industrialmente. Nos anos recentes, a maior parte da produção do ácido lático tem sido destinada à síntese do polímero polilactídeo (PLA), um bioplástico termoestável e compostável que pode substituir a utilização de plásticos convencionais derivados de petróleo. Uma das vias de obtenção do ácido lático é através da fermentação microbiana utilizando fontes de carbono renováveis, como a cana-de-açúcar. A produção via fermentação microbiana requer melhorias no bioprocesso para que o PLA se torne comercialmente competitivo. A redução da formação de coprodutos é um dos maiores desafios na produção via fermentação microbiana. Em trabalhos anteriores do nosso grupo, a levedura Komagataella phaffii foi utilizada para a construção de linhagens produtoras de L-lactato a partir de glicerol, atingindo até o momento, o rendimento máximo e 0,68 (g/g) em batelada-alimentada. Ao avaliar as cepas de K. phaffii construídas, há indícios de que as modificações anteriores, como a deleção da piruvato descarboxilase 1, resultam em um desbalanço do equilíbrio redox NADH/NAD+ o que poderia explicar a produção de arabitol como coproduto e a dificuldade em melhorar o rendimento de ácido lático. Portanto, diferentes alvos para expressão e nocaute foram avaliados neste trabalho com o objetivo de (i) corrigir o balanço redox na cepa GLp para evitar a redirecionamento do fluxo para vias competitivas; (ii) viabilizar a produção de ácido lático em aerobiose; (iii) expressar diferentes LDHs com a superexpressão do transportador de membrana de lactato. As modificações propostas podem auxiliar para melhor compreender a fisiologia de K. phaffii e assim melhorar o rendimento da produção de lactato a partir de glicerol.

O maracujá é uma planta tropical (gênero Passiflora, família Passifloraceae) cultivada em diversas regiões do mundo. Atualmente o Brasil é destaque por ser o maior produtor do fruto, por ter um dos maiores centros de origem e de diversidade da espécie, bem como, abrigar um dos maiores bancos de germoplasma de Passiflora destinados a conservação e preservação da espécie, e o uso dos recursos genéticos que destas plantas dispõe em programas de melhoramento genético. Diversos sintomas de etiologia viral têm sido relatados na cultura no país, entretanto estudos sobre esses vírus ainda são escassos. Em etapas anteriores deste trabalho, foram identificados vírus ainda não descritos infectando maracujazeiros no país. A fim de expandir ainda mais o conhecimento sobre a diversidade viral afetando esta importante cultura, este estudo objetivou investigar a diversidade de vírus em espécies de Passiflora no Brasil e caracterizar novos vírus identificados. Para isso, diversos maracujazeiros cultivados em campos comerciais foram amostrados em várias regiões do país, bem como, acessos de Passiflora spp. mantidas no Banco de Germoplasma “Flor da Paixão”, situado no Distrito Federal. Neste estudo usamos e combinamos várias ferramentas e metodologias a fim de caracterizar os vírus presentes nestas plantas. Isto inclui, tecnologia de sequenciamento de alto rendimento (do inglês, HighThroughput Sequencing- HTS), ferramentas de bioinformática, RT-PCR, PCR, clonagem molecular, RACE (do inglês, 5'- and 3'-rapid amplification of cDNA ends), Southern Blotting, e sequenciamento de Sanger. Nossos resultados identificaram a ocorrência inédita de vários vírus (novas espécies, e vírus descritos em outras culturas) infectando diferentes espécies cultivadas e não cultivadas em passiflora. O cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV, gênero Potyvirus, família Potyviridae), lettuce chlorosis virus (LCV, gênero Crinivirus, família Bromoviridae), cowpea mild mottle virus (CPMMV, gênero Carlavirus, família Betaflexiviridae), bean associated cytorhabdovirus (BaCV, espécie Cytorhabdovirus caricae, gênero Cytorhabdovirus, família Rhabdoviridae), e curcubit aphid-borne yellow virus (CABYV, gênero Polerovirus, família Solemoviridae), e as novas espécies candidatas da família Rhabdoviridae, dentro gênero Cytorhabdovirus nomeado de passiflora cytorhabdovirus (PaCV-BAG3), e no gênero Alphanucleorhabdovirus os nomeados de passiflora nucleorhabdovirus 2 (PaNV2-BAG3), e passiflora nucleorhabdovirus 1 (PaNV1-PM1BA). Esses vírus foram identificados em sua grande maioria em infecção mista com pelo menos um vírus, principalmente com o CABMV, que é o principal vírus que afeta a cultura no Brasil. Nossos dados também revelam que esses vírus não estão restritos apenas a uma região/estado. Ainda caracterizamos isolados CABYV de maracujazeiros, e comparando com cepas da mesma espécie, o que revelou um complexo de dez distintos vírus que foram caracterizados anteriormente como pertencentes a mesma espécie. Nossos resultados expandem a diversidade viral conhecida em maracujazeiros no Brasil e no mundo. Estas informações serão extremamente úteis para entender a epidemiologia destes vírus no país, para o desenvolvimento de estratégias de controle mais eficazes dessas viroses, e ainda servirão como suporte em programas de melhoramento genético envolvendo a cultura.

Lipossomas são vesículas concêntricas formadas por fosfolipídeos e são utilizados em vários setores da indústria, seja farmacêutica, alimentícia e até agrícola. Geralmente veiculam compostos isolados. O presente estudo foi conduzido visando extrair fosfolipídeos de materiais botânicos in natura e formular lipossomas para transporte de extratos da mesma origem botânica a fim de conferir atividades antimicrobianas, antioxidante e que não causem efeitos adversos em células eucarióticas para futura aplicação tópica. A partir de metodologia adaptada de tecnologia, com patente depositada previamente, foi possível extrair fosfolipídeos das folhas e caules de 20 espécies vegetais, e constatar que pelo menos 17 delas possibilitavam formular lipossomas sendo seus conteúdos água (Lipossoma vazio - LpV) ou extrato (Lipossoma cheio - LpC). Uma vantagem percebida no presente método é a não necessidade de extrusão por membrana ou outras técnicas de uniformização, tornando a produção de lipossomas mais acessível. Em LpV foram confirmados por espectroscopia Raman picos correspondentes à formação de lipossomas, também confirmada pela presença de fosfolipídeos nas nanoestruturas por termogravimetria. Essas nanoformulações foram testadas frente a Escherichia coli e Staphylococcus aureus, sendo que apenas 4 delas apresentaram atividade frente a S. aureus. E desses 4 lipossomas veiculando extratos etanólicos/aquosos (LpC.sec.et), apenas 2, os que carreavam extrato de alfazema e orégano na concentração de 250 mg/mL revelaram potencial antimicrobiano e antioxidante, preservando a viabilidade das células eucarióticas das células. Em ensaio com levedura Saccharomyces cerevisiae, os LpC.sec.et de alfazema e orégano demonstraram atividade fungistática no microrganismo, enquanto os extratos livres não demonstraram esse efeito, sendo que apenas LpC.sec.et de orégano demonstrou atividade fungicida. Dos LpC.sec.et, as taxas de encapsulamento encontradas foram de 56,33% e 91,70% para as espécies alfazema e orégano, respectivamente. Por microscopia de força atômica foi possível comprovar a presença de estruturas concêntricas compatíveis com a formação de lipossomas. Para conferir uma maior estabilidade e entrega sustentada dos lipossomas e seu conteúdo foi formulado um hidrogel com 3% de agarose e 2,5% de carboximetilcelulose. Esse hidrogel apresentou uma taxa de intumescimento adequada para aplicações terapêuticas, como aquelas esperadas para aplicações tópicas. A formulação de lipossomas incorporados em hidrogel ainda apresentou ação sobre S. aureus. Em teste de liberação em membrana de diálise, foi possível observar que o tempo necessário para o hidrogel liberar 90% do conteúdo lipossomal foi de 35 h, permanecendo a maior parte do tempo apresentando liberação sustentada a taxas relativamente constantes. Com base nos resultados obtidos foi possível a formulação de lipossomas 100% de origem vegetal com atividade antimicrobiana (bactéria Gram-positiva e levedura), atividade antioxidante e sem toxicidade para células eucarióticas.

Os cupins consomem aproximadamente 3 a 7 bilhões de toneladas de materiais lignocelulósicos por ano e, portanto, representam um dos decompositores de lignocelulose mais prolíficos e eficientes da Terra. A bioconversão de polissacarídeos da parede celular por cupins é um processo altamente coordenado alcançado pelos simbiontes microbianos residentes no intestino. Neste trabalho objetivamos utilizar o potencial biotecnológico desses microrganismos para a obtenção de enzimas capazes de converter os polissacarídeos em produtos químicos de alto valor agregado e entender como as GHs se distribuem no instestino da espécie. O processo foi realizado com o metagenoma intestinal bacteriano de Syntermes wheeleri, uma espécie endêmica de cupins do cerrado brasileiro. Aqui desenvolvemos análises de bioinformática integrada que sugeriu grupos de proteínas em árvores filogenéticas com potencial de inovação. Os domínios dessas proteínas foram distribuídos em Glicosil Hidrolases (GHs) - 3, 5, 9 e 10 com representantes dos filos Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes e Spirochaeta, entre outros. Com o objetivo de caracterizar e avaliar o potencial biotecnológico utilizamos E. coli BL21(DE3) e os sistemas de plasmídeos pET para sintetizar alguns deles. Os resultados bioquímicos demonstraram 40-50ºC como a melhor temperatura de atividade para Exo8574 (exoglucanase) e Bgl7226 (β-glicosidase), além de apresentarem pH ácido e básico como pH ótimo, respectivamente. O dicroísmo circular demonstrou a dependência da estrutura secundária pelo pH de acordo com a mudança nas quantidades de α-hélices e folhas β. Essas características proporcionaram as melhores condições para a sacarificação. Este processo pode ser usado em diferentes biomassas, como cana-de-açúcar e espiga de milho, usando o tratamento térmico como um processo de pré-tratamento ambientalmente sustentável, em comparação com o pré-tratamento químico, para melhorar o acesso de proteínas aos polissacarídeos. Nossos resultados ajudarão a elucidar a capacidade das enzimas selecionadas do metagenoma de bactérias intestinais de S. wheeleri em processos de biotecnologia de bioconversão de lignocelulose

Teorias coevoluƟvas descrevem a distribuição de probabilidade de proteínas que interagem em termos de um modelo estaơsƟco de Boltzmann. Como resultado de pressões seleƟvas, espera-se que essa distribuição se desvie acentuadamente da uniformidade apresentando um número relaƟvamente pequeno de sequências muito prováveis em todo o espaço de sequências. Enquanto essa afirmação deva ser verdadeira para sistemas interólogos em geral, suas distribuições de sequência podem não ter sido totalmente moldadas por pressões seleƟvas, abrindo a possibilidade de que novas sequências interólogas possam ser selecionadas a parƟr de distribuições de menor entropia geradas arƟficialmente. O objeƟvo desse trabalho foi invesƟgar o significado İsico de novas sequências selecionadas a parƟr de paisagens de fitness arƟficiais. Para isso, exploramos um Algoritmo GenéƟco, que resolve a distribuição maximizando os acoplamentos estaơsƟcos, começando de um alinhamento múlƟplo de sequências naƟvo e explorando o espaço de alinhamentos múlƟplo de sequências embaralhados. Também resolvemos uma distribuição minimizando os acoplamentos estaơsƟcos através do embaralhamento ao acaso do alinhamento múlƟplo de sequências. Uma vez que as sequências arƟficiais foram selecionadas a parƟr das distribuições maximizadas e minimizadas, suas energias livre de ligação em uma pose de interação naƟva fixa foram avaliadas de acordo com os cálculos de energia livre baseados no método MM/PBSA. Para avaliar o senƟdo İsico das sequências naƟvas e arƟficiais calculamos a temperatura de seleção em relação a sequências aleatórias de mesma composição. Nossos resultados apontam que é possível selecionar novas sequências arƟficiais não-similares em temperaturas de seleção mais frias ou mais quentes que a temperatura de seleção naƟva e, que as sequências arƟficiais selecionadas apresentam diferenças apenas quanto a especificidade, mas não em relação a afinidade de ligação. É possível concluir que a evolução molecular da interação de dímeros não-obrigatórias pode ser restrita somente pela especificidade, já que a afinidade deve ser apenas consequência da composição de aminoácidos determinada pelas restrições de enovelamento. Além disso, constata-se a possibilidade de encontrar novas interações proteína-proteína com caracterísƟcas iguais ou melhores que as interações existentes na natureza.

É previsto que as mudanças climáticas em curso irão intensificar a ocorrência de eventos climáticos extremos e agravar o impacto de pragas e patógenos sobre a produção agrícola, colocando em risco a segurança alimentar de uma população em contínuo crescimento. Dentro deste contexto, a cultura do amendoim apresenta grande relevância por constituir importante fonte nutricional, sendo cultivada, predominantemente, em trópicos semiáridos por agricultores com poucos recursos. O déficit hídrico e a infecção por nematoides das galhas (Meloidogyne spp.) representam condições de estresse que impõe significativas limitações à produtividade e qualidade da produção de diversas culturas agrícolas, incluindo a espécie cultivada de amendoim (Arachis hypogaea), a qual apresenta alta suscetibilidade a tais condições. Por outro lado, seus parentes silvestres apresentam maior tolerância/resistência a estresses abióticos e bióticos e o estudo dos mecanismos de resposta ao estresse destas espécies pode contribuir tanto para aprofundar o conhecimento sobre processos regulatórios, vias de sinalização e proteínas associadas como para o descobrimento de alelos ligados à tolerância/resistência, os quais podem ser utilizados em programas de melhoramento ou para o desenvolvimento de aplicações biotecnológicas. Dentre os mecanismos de controle da expressão gênica, a regulação pós-transcricional realizada por microRNAs, uma classe de pequenos RNAs regulatórios, exerce papel fundamental nos processos de crescimento, desenvolvimento e resposta a condições de estresse abiótico e biótico em organismos vegetais. No presente estudo, a fração de pequenos RNAs de amostras de tecidos radiculares de plantas de Arachis duranensis submetidas à diminuição gradual de água no solo ou inoculadas com juvenis J2 da espécie Meloidogyne arenaria foram sequenciadas (sRNA-Seq) e os dados resultantes foram analisados com o objetivo de identificar loci MIR conservados e inéditos, verificar loci MIR diferencialmente expressos e predizer os genes alvo putativos de loci MIR identificados. Foram identificadas 32 famílias conservadas de miRNAs e 21 loci MIR inéditos, com a predição de genes alvo putativos para a maioria dos loci identificados. A análise da expressão diferencial revelou cinco famílias de miRNAs conservados e um locus MIR inédito diferencialmente expressos em amostras inoculadas com juvenis J2 da espécie M. arenaria, enquanto 18 famílias de miRNAs conservados e cinco loci MIR inéditos foram diferencialmente expressos em amostras submetidos a déficit hídrico. Sob infecção por nematoides das galhas, as principais vias metabólicas influenciadas pelos miRNAs diferencialmente expressos estão relacionadas à biossíntese de ácido jasmônico (JA), à via de sinalização de auxinas (AUX) e a modificações da estrutura da parede celular, como, por exemplo, lignificação e hidrólise de polissacarídeos componentes da matriz de pectina. Sob diminuição gradual do conteúdo de água no solo, as principais vias metabólicas influenciadas pelos miRNAs diferencialmente expressos estão relacionadas à via de sinalização dependente de ABA, à via de sinalização independente de ABA, à via de sinalização de auxinas e à homeostase redox intracelular. Além da identificação de novos loci MIR, provavelmente espécie específicos, os resultados obtidos pelo estudo podem servir como referência para posteriores estudos sobre mecanismos regulatórios em espécies de Arachis e para o desenvolvimento de aplicações biotecnológicas visando a tolerância/resistência a estresses.

As esponjas e seus organismos associados possuem grande importância no ambiente marinho, atuando em diversos processos ecológicos. Eles ainda são uma fonte relevante de compostos bioativos que podem ser explorados biotecnologicamente. O Recife Amazonas é uma região peculiar que abriga enorme diversidade de seres vivos. O local é marcado pela vazão de água e sedimentos vindos do Rio Amazonas, formando uma pluma de sedimentos que impacta parâmetros físico-químicos e os organismos habitantes. Tendo isso em mente, foi feita a análise, através de métodos de bioinformática, de aspectos genéticos e metabólicos de 10 MAGs oriundos da microbiota de esponjas do Recife Amazonas com o intuito de saber sobre as possíveis contribuições desses microrganismos para o ecossistema e o hospedeiro e sobre a possibilidade de uso biotecnológico. O projeto iniciou com a coleta de amostras de tecido de esponjas do recife, seguida pela extração e sequenciamento do DNA metagenômico. A partir dele, foram recuperados mais de 200 MAGs de boa qualidade, sendo escolhidos 10, com base em classificações preliminares, para análise mais detalhada. Em seguida, foram desenvolvidos os seguintes procedimentos in silico: determinação da qualidade dos genomas e da similaridade entre eles, definição da taxonomia, reconstrução metabólica e busca por compostos bioativos. Todos os MAGs apresentaram qualidade entre média e alta, com contaminação abaixo de 10% e completude acima de 70%. Valores de ANI e dDDH indicam que dois pares de MAGs provavelmente pertencem à mesma espécie. Além disso, os MAGs foram classificados no mesmo filo, Latescibacterota, e classe, UBA2968. A reconstrução metabólica demonstrou a presença de genes relacionados à heterotrofia, com processos aeróbicos e anaeróbicos para obtenção de energia. A identificação de genes envolvidos nas vias de biorremediação e nos ciclos do nitrogênio, enxofre e fósforo mostram possíveis contribuições para o recife. Genes ligados à síntese de nutrientes e outros produtos úteis, à desintoxicação de metais pesados, e à defesa química foram encontrados, indicando possíveis benefícios ao hospedeiro. Do ponto de vista biotecnológico, os MAGs contêm alguns genes ligados à produção de metabólitos secundários e que codificam enzimas de interesse comercial e industrial. Também foram identificados peptídeos bioativos que possuem diversas propriedades. Assim, esse trabalho mostrou possíveis papéis desses microrganismos no recife, possíveis benefícios às esponjas, além de formas de exploração biotecnológica.

Apenas no ano de 2020, a malária infectou aproximadamente 241 milhões de pessoas e levou aproximadamente 627 mil pacientes a óbito, causada principalmente pela espécie Plasmodium falciparum. O tratamento medicamentoso continua a ser a principal forma de controle da malária. Porém, devido a um crescente aumento da resistência dos parasitos contra os principais fármacos utilizados evidencia a necessidade de descoberta de novos fármacos antimaláricos, uma vez que não existe uma alternativa aos atuais antimaláricos derivados de artemisinina. O ciclo eritrocitário, que leva a produção das formas infectivas, os merozoítos, é responsável pela sintomatologia da doença. A morfogênese do merozoíto é complexa, exige um tráfego intracelular preciso e intenso e leva a formação de organelas peculiares. Falhas nesses processos celulares podem ocasionar a morte celular. Os membros da família de proteínas dinaminas são conhecidos por estar envolvidos nesses processos e, portanto, podem ser os responsáveis por essa regulação mecanoquímica. O P. falciparum possui em seu genoma as sequencias codantes de três dinaminas, PfDYN1, PfDYN2 e PfDYN3, que foram preditas como participantes desses processos. Tendo em vista a necessidade de novos alvos para fármacos, o trabalho visou o melhor entendimento das estruturas dessas dinaminas e a triagem de possíveis inibidores específicos, por análise de Bioinformática. Modelos tridimensionais dessas proteínas foram construídos, refinados e analisados. Os modelos 3D obtidos através do servidor AlphaFold foram considerados os melhores e mais robustos. A partir das estruturas 3D de PfDYN1 e PfDYN2, servidores de predição de sítios permitiram a predição de seus sítios de interação molecular, que foram utilizados no docking molecular. Foram selecionadas classes de inibidores conhecidos de dinaminas como, por exemplo, dynasore, dyngo, dynole, iminodyn e rhodadyn como a base estrutural para a geração da biblioteca de priorização de compostos por meio da similaridade estrutural na biblioteca comercial ChemBridge. Doze compostos foram selecionados como candidatos promissores a inibidores das PfDYN1 e PfDYN2, os quais serão futuramente testados em ensaios in vitro. Futuramente, a inibição de crescimento do parasito por curva de dose-resposta in vitro, assim como a inibição enzimática, serão testadas. Espera-se encontrar dentre essas moléculas novas ferramentas de estudo do tráfego intracelular e da formação das organelas de P. falciparum assim como base na elaboração de inibidores letais para o parasito

Pertencentes ao filo Arthropoda, os escorpiões representam aproximadamente 1,5% das espécies de aracnídeos existentes. Dentro do território brasileiro, são encontradas diversas espécies de escorpiões, estando presente em todos os estados do país. Dentre as espécies de maior importância e abundância estão os animais pertencentes ao gênero Tityus, devido a sua grande variedade e importância médica. Uma espécie de destaque é o Tityus stigmurus, espécie endêmica do Nordeste do Brasil. Essa espécie se destaca por ser a maior causadora de acidentes nesta região do país, sendo responsável pelo grande número de casos graves de picadas, levando a internações e casos de morte. A peçonha destes animais é formada por diversos compostos diferentes, no qual os que mais se sobressaem são peptídeos, também conhecidos como neurotoxinas. Essas neurotoxinas são capazes de interagir e afetar o funcionamento de canais iônicos tais como potássio (Kv), cálcio (Cav) e sódio dependente de voltagem (Nav), responsáveis pela propagação e iniciação de sinais nervosos. Neste trabalho, a peçonha do escorpião Tityus stigmurus foi extraída e submetida ao processo de fracionamento utilizando a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa (RP-HPLC). As frações coletadas foram analisadas em Espectrômetro de Massa (MALDI-TOF) e as frações de interesse foram separadas e sequenciadas de forma parcial pelo método de ISD. Após o processo de purificação e identificação, as toxinas purificadas, correspondente às toxinas Tst1 e Tst3, foram testadas em canais de sódio dependentes de voltagem (subtipos Nav 1.1 a 1.7) utilizando a técnica de patch-clamp no modo whole cell. A toxina Tst1 demonstrou uma atividade característica da classe das β-toxinas, alterando o potencial de abertura dos canais de sódio (Nav) e inibindo a corrente dos mesmos, tendo uma ação superior no subtipo Nav 1.3. Já a toxina Tst3 manifestou uma atividade característico das α-toxinas, alterando a inativação rápida dos canais de sódio, sendo os subtipos Nav 1.3, 1.6 e 1.7 os mais comprometidos. Assim, as toxinas Tst1 e Tst3 são as primeiras toxinas purificadas da peçonha de Tityus stigmurus amplamente caracterizadas em diferentes isoformas de canais de sódio (Nav).

O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das principais hortaliças produzidas no Brasil e no mundo, apresentando grande importância econômica, social e alimentar. A mosca-branca (Bemisia tabaci) e os vírus por elas transmitidos, especialmente os begomovírus, estão entre os principais problemas fitossanitários que afetam a cultura. O controle químico é a prática mais utilizada no combate à mosca-branca, entretanto a manifestação de resistência aos inseticidas, evidencia a necessidade de estratégias mais eficazes de controle desse inseto-vetor e dos vírus por eles transmitidos. A estratégia de RNAi foi utilizada para a obtenção de plantas de tomateiro resistentes à mosca-branca e a múltiplas begomoviroses. Explantes cotiledonares da cv. Micro-Tom foram transformados via Agrobacterium tumefaciens EHA 105, contendo o plasmídeo de interesse. Foram utilizados dois plasmídeos possuindo o gene de seleção nptII: o pC2300ATPase, contendo um cassete de supressão para o silenciamento do gene vATPase de mosca-branca; e o pC2300-p4-gemini, contendo um cassete de supressão quimérico para expressar dsRNAs com homologia a sequências do gene rep de quatro importantes espécies de begomovírus associados ao tomateiro. Dos explantes transformados com o pC2300ATPase, foram obtidas 9 linhagens transgênicas, confirmadas por PCR pela detecção dos transgenes ΔATPase e nptII. Análise da progênie confirmou a presença dos transgenes na geração T1, co-segregando em proporção mendeliana 3:1. siRNAs correspondentes ao gene ΔATPase foram detectados através da análise de Northern blot. A expressão da proteína NPTII não foi detectada em todas as linhagens através do imunoensaio de fluxo lateral, não apresentando correlação direta com a expressão do transgene ΔATPase. Linhagens expressando siRNA foram desafiadas contra a mosca-branca e revelaram uma taxa de mortalidade de 57,1% na linhagem transgênica 4.4.1, enquanto no controle a mortalidade foi de 7,6%. A mortalidade das ninfas no 2º instar foi maior nas plantas transgênicas e o tempo de desenvolvimento das ninfas no 3º instar foi ligeiramente maior nas plantas transgênicas do que nas plantas do controle. Embora a atração dos insetos não tenha sido significativamente diferente entre os tratamentos, o número de ovos postos pelos insetos nas plantas transgênicas foi significativamente menor, em comparação com os controles. RT-qPCR revelou uma diminuição do nível de expressão do gene endógeno v-ATPase em moscas-brancas que se alimentaram de plantas transgênicas. Nenhum efeito inesperado foi observado sobre os insetos não-alvo Myzus persicae ou Tuta absoluta. Dos explantes transformados com o pC2300-p4-gemini, foram obtidas 2 plantas transgênicas, confirmadas por PCR, pela detecção do transgene Δp4Gemini. Análise da progênie confirmou a presença do inserto na geração T1, segregando em proporção mendeliana 3:1. As plantas da progênie foram desafiadas com o agente viral TMoLCV e algumas plantas positivas apresentaram fenótipo de resistência ao vírus, sem detecção do DNA viral após 30 dias da inoculação.