A superpopulação de animais errantes é um problema global, levantando preocupações sobre a reprodução descontrolada e riscos à saúde pública. A nanotecnologia oferece um potencial para castração através da fotohipertermia mediada por nanopartículas (FHT), mostrando-se promissora para o controle da população animal. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da fotohipertermia testicular mediada por nanopartículas de maghemita recobertas com citrato e ouro (NPAu) e nanopartículas de ferrita de manganês funcionalizadas com citrato (NPCit) nos parâmetros reprodutivos de ratos Wistar. Foram utilizados no total 49 ratos Wistar (aproximadamente 10 semanas de idade). O tratamento por FHT foi realizado com a injeção intratesticular de 150 μL do fluido (NPAu ou NPCit) combinados com a irradiação de LED visando atingir a temperatura de aproximadamente 45 oC por 15 minutos. Avaliações de parâmetros reprodutivos foram feitas até 56 dias, tempo necessário para que ocorra a espermatogênese completa em ratos. Os resultados mostraram que a FHT testicular mediada pelas NPAu proporcionou danos progressivos a parâmetros reprodutivos dos animais, como: redução do volume testicular e redução da porcentagem de espermatozoides móveis, porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais e número de espermatozoides na cauda dos epidídimos. Além disso, a avaliação histopatológica dos testículos aos 7, 28 e 56 dias após o tratamento revelou dano progressivo aos túbulos seminíferos. No entanto, túbulos seminíferos intactos ainda estavam presentes até o final das avaliações, sugerindo que o efeito não foi completo. A FHT testicular mediada pelas NPCit inicialmente mostrou resultados semelhantes aos obtidos com a NPAu, porém foi possível identificar que os túbulos seminíferos intactos estavam localizados na periferia dos testículos, mesmo com a presença de aglomerados de nanopartículas na região. Este achado sugeriu uma ineficiência na penetração da luz no tecido, que possivelmente não estava atingindo as nanopartículas do lado oposto à incidência do LED. Assim, um novo equipamento com 2 LEDs foi utilizado para a FHT mediada por NPCit, e os resultados mostraram uma destruição mais homogênea dos túbulos seminíferos. A análise histopatológica mostrou danos irreversíveis à espermatogênese, com agravamento progressivo com o passar do tempo. Além disso os parâmetros espermáticos e a morfometria testicular também foram afetados negativamente. Em todos os casos, independente da nanopartícula utilizada, não houve dor ou comprometimento do ganho de peso dos animais, e a histologia de fígado, baço, rim e pulmões não foi afetada pelo procedimento. Em conclusão, a aplicação de fotohipertermia mediada por nanopartículas (NPCit e NPAu) diretamente aos testículos resultou em efeitos prejudiciais importantes aos parâmetros reprodutivos de ratos em um período de curto prazo (56 dias), se mostrando um procedimento promissor para causar infertilidade em animais machos.

O uso indiscriminado de antibióticos tem provocado elevados níveis de resistência bacteriana ao redor do mundo. Esse cenário se intensificou significativamente após o período pandêmico de SARS- COV 2, onde agentes antimicrobianos foram utilizados desenfreada e erroneamente, mesmo que indicados apenas no caso de confeição com bactérias ou fungos. Com isso, ocorreu um aumento expressivo de superbactérias resistentes, levando à necessidade do uso de antibióticos de alto espectro e graves efeitos colaterais, como é o caso da Polimixina B, um medicamento associado a intensa nefrotoxicidade e uma das últimas alternativas de tratamento para superbactérias hospitalares. Diante disso, pesquisas envolvendo moléculas com potencial antimicrobiano são de grande importância para a sociedade e tem ganhado espaço no meio científico. Uma interessante opção para esse quadro é o estudo de moléculas antimicrobianas naturais, como é o caso dos peptídeos antimicrobianos (PAMs) também chamados de peptídeos de defesa do hospedeiro (PDHs). Esses peptídeos são moléculas curtas, catiônicas, anfipáticas e abundantes na natureza, sendo muito encontrados na secreção cutânea de anfíbios. Nesse trabalho, foi isolado um potente peptídeo antimicrobiano presente na secreção cutânea de Pithecopus rohdeii, uma espécie da família Phylomedusidae. A fração ativa foi isolada por cromatografia líquida de alta eficiência e apresentou uma massa de 3080,66 Da. A molécula foi sequenciada por degradação de Edman e apresentou uma sequência peptídica de 30 resíduos de aminoácidos (GLWKMLAKGAGKVLGHVASKFLGSQGQPES-COOH). Por estudos de similaridade de sequência, foi observado que esse peptídeo possui alta similaridade de sequência com peptídeos da classe das dermaseptinas, sendo então denominado Dermaseptina PR-1 (PR em referência à espécie Pithecopus rohdei). Através de análises de dicroísmo celular (DC), a estrutura secundária do peptídeo na presença de SDS e TFE foi avaliada, sendo possível inferir que a Dermaseptina PR-1 forma uma estrutura em alfa-hélice quando em contato com as membranas, um padrão associado à respostas antimicrobianas em outros peptídeos de defesa. No que diz respeito a testes biológicos, o peptídeo apresentou resultados inibitórios no crescimento das bactérias Grampositivas Staphylococcus aureus (CIM = 4 M), Staphylococcus epidermidis (CIM = 4 M) e Enterococcus faecalis (CIM = 16 M) e Gram-negativas Escherichia coli (CIM = 1 M), Klebsiella pneumoniae (CIM = 2 M) e Pseudomonas aeruginosa (CIM = 4 M), sendo observado, também, a atividade antibacteriana em um isolado clínico multirresistente de Klebsiella pneumoniae carbapenemase, resultado que foi corroborado por teste de microscopia eletrônica de varredura(MEV) onde se pôde observar a formação de poros e profundas rugosidades na membrana dessa bactéria, que leva a desestruturação da parede e lise do microrganismo. Além disso, como um teste preliminar para avaliar a capacidade inunomodulatória dessa dermaseptina, o peptídeo foi testado quanto a sua capacidade de induzir a quimiotaxia de neutrófilos, onde se observou uma moderada atividade quimiotática. Esses resultados sugerem que o peptídeo pode atuar de forma dupla, erradicando bactérias de maneira direta e indireta. Por fim, a atividade hemolítica do peptídeo foi avaliada e resultou em um baixo percentual de hemólise nas concentrações relacionadas aos valores de CIMs de bactérias sensíveis (2% a 9% ) observando-se também uma moderada atividade hemolítica na concentração inibitória da superbactéria Klebsiella pneumoniae carbapenemase (23%).

O presente estudo testou duas técnicas de criopreservação (vitrificação e congelamento lento) com combinações diferentes de crioprotetores. Para realizar o estudo, foram utilizados os ovários de 10 gatas submetidas a ovariohisterectomia eletiva na clínica veterinária Casa do Gato, localizada em Brasília, DF. No total, foram coletados 20 ovários, cada um dos quais foi dividido em oito fragmentos de 3mm³. Dois fragmentos de cada ovário foram imediatamente fixados para o controle fresco, enquanto os outros seis foram divididos em três para serem vitrificados e três para serem criopreservados por congelamento lento. Para o processo de vitrificação, diferentes soluções de equilíbrio (SE) e de vitrificação (SV) foram testadas. Essas soluções incluíam 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) associado a 10% de etilenoglicol (EG) e combinado com 0,1M de trealose no SE, e 20% de DMSO e 20% de EG com 0,1M de trealose no SV (V1). Outra solução consistiu em 10% de DMSO associado a 10% de EG e combinado com 0,1M de sacarose no SE, e 20% de DMSO e 20% de EG com 0,1M de sacarose no SV (V2). Uma terceira solução foi composta por 20% de DMSO combinado com 0,1M de trealose no SE e 40% de DMSO combinado com 0,1M de trealose no SV (V3). Para a congelamento lento, as soluções consistiram em 1M de DMSO, 1M de EG e 10% soro fetal bovino (SFB) combinados à 0,4% trealose (CL1), 1,5 M de DMSO e 10% SFB combinados com 0,4% sacarose (CL2) ou 0,4% trealose (CL3). Todas as amostras foram armazenadas em nitrogênio líquido durante pelo menos sete dias e os fragmentos foram descongelados ou desvitrificados e fixados após esse período. Foram realizadas análises histológicas para a contagem e classificação de folículos pré-antrais e testes imunohistoquímicos para avaliar se os folículos estavam proliferativos. O grupo V1, teve a maior taxa de preservação da reserva folicular primordial e de folículos em crescimento e mostrou ser a mais eficaz na sobrevivência folicular. Assim, é possível inferir que a vitrificação com uso de 10% DMSO, 10% EG e 0,1M trealose mostrou efeitos benéficos, mas estudos futuros são necessários para maior comprovação da eficácia dos protocolos apresentados.

Os peptídeos antimicrobianos são moléculas produzidas naturalmente por uma variedade de organismos, incluindo anfíbios como sapos e rãs que os secretam na pele como uma forma de defesa contra patógenos. Esses peptídeos atuam contra uma ampla gama de bactérias, fungos e vírus e possuem potencial terapêutico significativo devido à sua capacidade de matar microrganismos sem causar danos às células humanas. A aplicação desses peptídeos é promissora em diversas áreas, como no desenvolvimento de novos antibióticos e no tratamento de infecções. Além disso, eles estão sendo estudados como uma alternativa aos antibióticos tradicionais que são cada vez mais ineficazes devido à seleção de genes de resistência microbiana. No entanto, apesar do potencial promissor desses peptídeos, ainda há muita pesquisa a ser feita para entender melhor sua eficácia em diferentes contextos e a viabilidade de sua aplicação em grande escala. Além da atividade antimicrobiana, os peptídeos presentes na secreção cutânea de anuros também podem exibir atividade imunomodulatória, o que significa que eles podem afetar a função do sistema imunológico. Esses peptídeos podem agir como agentes pró-inflamatórios ou anti-inflamatórios, regulando a resposta imunológica do organismo. O presente projeto teve como objetivo avaliar o efeito antibacteriano e sinérgico dos peptídeos antimicrobianos pentadactilina e falaxina em bactéria multirresistente Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). Adicionalmente, foi avaliada a resposta de neutrófilos humanos expostos a essas moléculas. A purificação por RPHPLC e a análise por espectrometria de massas revelou um alto grau de homogeneidade desses peptídeos para a realização dos ensaios propostos. Ambos os peptídeos apresentaram atividade antibacteriana contra bactéria KPC (Concentração Inibitória Mínima, CIM = 128 μM para os dois peptídeos), e os danos promovidos foram avaliados por microscopia eletrônica de varredura (MEV), em que se evidenciou deformações na membrana dessa bactéria, o que possivelmente leva à desestruturação da parede e lise do microrganismo. Os testes de combinação de drogas entre os peptídeos e o antibiótico polimixina B indicaram que ambos apresentam efeitos sinérgicos, diminuindo a CIM quando testados contra a bactéria KPC. Na avaliação de seus efeitos imunomodulatórios, ambos os peptídeos não apresentaram resultados significativos quando modularam a resposta fagocitária dos neutrófilos. A falaxina promoveu uma diminuição na produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Ambos os peptídeos não exibiram potencial quimiotático. Os efeitos sinérgicos e imunomodulatórios sobre neutrófilos dos peptídeos pentadactilina e falaxina demonstram outras possibilidades de aplicação terapêutica para esses peptídeos.

O Brasil é o país mais populoso da América Latina e o sétimo no ranking mundial sendo sua população resultante de um longo processo de miscigenação com contribuições dos povos originários nativos americanos e de povos europeus, africanos, asiáticos e do Oriente Médio. O perfil de miscigenação da população brasileira está sendo construído ao longo dos últimos cinco séculos, a partir de uma complexa combinação de grupos parentais raramente vista em outras partes do mundo. Um importante papel para auxiliar a desvendar a história das populações e seu processo de formação tem sido exercido pelos estudos genéticos. Ao longo das últimas décadas, a genética de populações tem passado por grandes transformações tecnológicas e metodológicas, as quais têm possibilitado o acesso preciso e em larga escala de variáveis genéticas cada vez mais informativas. No primeiro capítulo desta tese nosso grupo trabalhou na comparação da inferência de ancestralidade genética a partir de diferentes conjuntos de marcadores genéticos: Marcadores Informativos de Ancestralidade (AIMs), array de alta densidade de SNPs (high density SNPs - HDSNPs) e Sequenciamento do Genoma Completo (Whole Genome Sequencing - WGS). Também testamos, diferentes modelos de miscigenação: o tri-híbrido (africano, europeu e nativo americano) e modelo de mistura tetra-híbrida (africano, europeu, nativo americano e leste asiático). Para tanto, analisamos 1.171 amostras miscigenadas do Brasil e 504 amostras miscigenadas provenientes de populações da América do Projeto 1000 Genomas, ambos genotipados por WGS, com as quais comparamos: (i) 5 painéis AIMS (34AISNP+PIMA; 55AISNP ; 128AISNP; 170AISNP; 446AISNP), (ii); um array de alta densidade de SNPs (Axiom Human Origins - Thermo Fisher Scientific) e (iii) dados de sequenciamento de genoma completo (WGS), os quais foram selecionados por suportarem os modelos tri e tetra-híbridos de miscigenação. Mostramos que tanto a escolha do conjunto de marcadores como do modelo de miscigenação interferem nas inferências de ancestralidade em populações miscigenadas. A menor correlação entre os conjuntos de marcadores e modelos testados foi do componente ancestral Nativo Americano inferido. As melhores performances, em especial na capacidade de distinção entre os componentes Nativo Americano e Leste Asiático foram dos dados de HDSNPs e WGS. Por fim, concluímos e recomendamos que a escolha do conjunto de marcadores e do modelo de miscigenação dependerá da história de cada população miscigenada e do propósito do estudo. No segundo capítulo da tese, caracterizamos o perfil de ancestralidade genética de uma amostra populacional miscigenada brasileira do Distrito Federal. Com base nas informações geradas no capítulo 1, escolhemos realizar a genotipagem dessa amostra com HDSNPs (Axiom Human Origins - Thermo Fisher Scientific) e inferir a ancestralidade genética a partir de um modelo de miscigenação tetrahíbrido. O Distrito Federal (DF) é uma região situada no Centro Oeste do Brasil, receptora de um fluxo rápido, amplo e diversificado de indivíduos de toda parte do território nacional a partir da década de 60, quando da construção da capital federal. Para ajudar a reconstruir a história dessa população, realizamos análises do perfil de ancestralidade genética e coletamos informações demográficas numa amostra de 104 indivíduos, nascidos no DF na década de 80. Nosso estudo revelou: (i) com base na inferência de ancestralidade genética dos cromossomos autossômicos as proporções médias observadas foram de 69,95% (±18%) de ancestralidade europeia, 19,8%(±14,4%) africana, 8,57% (±7,2%) nativo americana e 1,68%(±8,6%) leste asiática; essas proporções não apresentam diferenças significativas em relação a média da população brasileira. (ii) As análises dos cromossomos sexuais (X, Y) e do DNA mitocondrial mostraram assinaturas do fenômeno demográfico de acasalamento direcional, com predomínio da contribuição de homens de ascendência europeia e de mulheres com ascendência africana e nativa americana. (iii) As análises demográficas indicam que os ancestrais dos participantes do estudo migraram principalmente das regiões Sudeste (43,64%) e Nordeste (38,22%), seguida pelas regiões Centro-Oeste (9,39%), Norte (5,52%) e Sul (1,65%); sendo 51,2% dos matrimônios ocorrendo entre indivíduos da mesma região geográfica. Nosso estudo mostra que o perfil de ancestralidade genética observado no DF é uma síntese das contribuições migratórias internas recentes do Brasil e de processos históricos anteriores a essa migração que deixaram fortes assinaturas genéticas no DNA e foram herdadas pela população do DF.

Microplásticos são partículas com tamanho entre 5 - 1 mm, são considerados poluentes emergentes e presentes no mundo todo. Em virtude do seu tamanho eles apresentam o potencial de atingir vários níveis da cadeia alimentar. Peixes e macroinvertebrados bentônicos estão suscetíveis a essa exposição e poucos dados na literatura relevam os efeitos adversos de microplásticos em organismos pequenos e de água doce. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial ecotoxicológico de microplásticos (MPs) de polietileno em duas espécies aquáticas, o peixe Danio rerio, ou zebrafish, e o caramujo bentônico de água doce Biomphalaria glabrata, além da caracterizar esses microplásticos (MPs). Em zebrafish a toxicidade foi avaliada por meio do teste de embriotoxicidade, pelo teste de depuração dessas micropartículas em juvenis e em adultos, por meio de testes de genotoxicidade, citotoxicidade, histologia e marcadores bioquímicos em exposições de 96 horas e 28 dias, com um período de recuperação de 14 dias. Em caramujos adultos de B. glabrata foi investigado a alteração de marcadores bioquímicos em uma exposição aguda de 96 horas e em um teste de recuperação de 49 dias, recuperação dependente. Além disso, verificou-se o potencial de depuração de MPs em juvenis e adultos de Biomphalaria glabrata. A caracterização dos microplásticos de polietileno por microscopia eletrônica de varredura e análise em programa FijiJ, que mostraram partículas esféricas, com uma média de 58 µm de diâmetro (± 4,52 dp). Em peixes, não foram observadas alterações significativas em embriões pelo teste de embriotoxicidade, e o teste de depuração em juvenis mostrou que no 12 º dia de recuperação eles eliminaram todas as MPs. Já nos adultos, na exposição aguda, houve uma inibição da amônia tóxica em todos os grupos expostos quando comparados ao controle água, a diminuição foi nove vezes menor no grupo de 100 mg.L-1 . Isso foi confirmado na exposição crônica, com valores de p significativos (< 0,05), tanto para microplástico quanto para o dispersante Tween 80 %. No teste de recuperação, a inibição de amônia tóxica deixa de ser significativa nos aquários que continham Tween 80 % após 8 dias. Nos aquários com microplásticos somente após 14 dias percebe-se que essa diminuição deixa de ser estatisticamente significativa. As análises histológicas mostraram que os MPs se acumulam no lúmen intestinal, mas não em outros órgãos. Não foi observado genotoxicidade nos testes do cometa, nos testes de micronúcleos e de citotoxicidade, por anomalias nucleares na exposição aguda. Houve diminuição significativa dos níveis de AChE tanto nos testes agudo e crônico em amostras da cabeça, e no teste de recuperação a diminuição ocorreu nas amostras da cauda (p < 0,05). A GST teve aumento significativo nos testes agudo, crônico e de recuperação (p < 0,05), e o LDH teve resultado estatisticamente significativo na exposição crônica (p < 0,05). Em adultos de B. glabrata, não foram observados valores estatisticamente significativos na concentração total de proteínas, na concentração de glicose, na atividade de LDH e AChE (p > 0,05). Entretanto, houve uma diminuição significativa (p < 0,05) na atividade de GST. No teste de depuração, os juvenis levaram 20 dias para eliminar totalmente os MPs e os adultos não conseguiram eliminar todas as partículas no total de 49 dias de recuperação em água mole sintética. Ademais, as análises em juvenis e adultos mostraram que as MPs também se concentram principalmente no estômago e no intestino desses caramujos. Verifica-se que esses microplásticos de polietileno esféricos com 58 µm de diâmetro, causaram estresse oxidativo em zebrafish, mas não o suficiente para causar genotoxicidade. Além disso, a capacidade de depuração em juvenis de zebrafish é significantemente rápida, em torno de 15 dias. Os MPs se acumulam no lúmen do intestino, e apesar disso, 14 dias de recuperação não foram o suficiente para que eles se recuperassem totalmente do estresse oxidativo. Em caramujos, esses MPs também causaram estresse oxidativo, porém, apenas em um marcador, o que revela que os caramujos B. glabrata são mais resistentes do que zebrafish a esses microplásticos de polietileno. Com relação a depuração, os juvenis se mostraram mais eficiente na eliminação de MPs do que caramujos adultos. Em conclusão, os efeitos toxicológicos de microplásticos de polietileno dependem da espécie ao qual estão sendo expostos, da concentração e do tempo de exposição.

A matriz extracelular descelularizada (MEC) de vários tecidos (coração, pulmão, rim, útero e testículo) está permitindo a regeneração e a recuperação das células nativas e das funções do tecido. Uma alternativa para manter a fertilidade em mulheres diagnosticadas com câncer, que se tornariam inférteis devido à quimioterapia e/ou radioterapia, é o desenvolvimento de um ovário artificial transplantável. A MEC descelularizada do tecido ovariano foi obtida usando dodecil sulfato de sódio (SDS), geralmente em uma concentração de 1% por 24 h. No entanto, o SDS pode deixar resíduos no tecido, que podem ser tóxicos para as células semeadas. Portanto, o objetivo do presente estudo foi obter uma matriz extracelular descelularizada de tecido ovariano de bovino com SDS, mas com menor concentração e menor tempo de incubação. Além disso, identificar as moléculas e as funções da MEC nativa e descelularizada. Para isso, ovários de bovino procedentes de abatedouro foram transportados ao laboratório em solução salina a 37 °C. No laboratório, folículos antrais foram puncionados com uma agulha, e a cápsula e a região medular do ovário foram removidas. Fatias (10 mm x 5 mm x 1 mm) foram obtidas da região cortical do ovário, pesadas e distribuídas entre os grupos de tratamento. A solução estoque de SDS foi preparada com 1% de SDS (Sigma-Aldrich, Brasil) e NaOH 0,2M em água destilada e depois diluída até as concentrações desejadas. As concentrações de SDS utilizadas foram 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% e 0,01% e tempos de incubação de 24 h, 12 h e 6 h. As fatias de ovário foram submersas individualmente em 10 mL de cada mistura, sob agitação constante (100 rpm), em temperatura ambiente e pelo período definido para cada tratamento. Em seguida, foram lavadas em 50 ml de água destilada por 6 horas, trocando a água destilada a cada 30 minutos. O tecido obtido de cada tratamento foi analisado por histologia, por eletroforese para avaliar o tamanho dos fragmentos de DNA remanescentes nas fatias ovarianas e por quantificação do DNA pelo Fluorômetro Qubit® 2.0 (Thermo Fisher Scientific). A análise histológica confirmou a descelularização e a coloração com tricrômico de Mallory mostrou a conservação das fibras de colágeno e elastina em todas as amostras após cada tratamento. Além disso, a menor concentração de SDS que não mostrou DNA remanescente na análise de eletroforese foi de 0,1%, quando incubado por 24 h e 12 h, mas não por 6 h. A viabilidade celular mostrou que a MEC descelularizada por incubação em 0,1% de SDS por 12 h não era tóxico para as células ovarinas durante o cultivo in vitro por 24 e 72 h. Também, foram identificadas as moléculas e funções da MEC nativa e descelularizada por 0,1% de SDS por 12 h através de análise da proteômica. Assim, foram identificação 155 proteínas na MEC nativa (87 proteínas centrais e 68 proteínas associadas a matrisome) e 145 proteínas na MEC descelularizada (84 proteínas centrais e 61 proteínas associada a matrisome). Ainda foram identificadas as funções biológicas e celulares das proteínas da MEC nativa e descelularizada. Desta forma, concluímos que o protocolo de 0,1% de SDS por 12 h de incubação descelulariza o tecido ovariano de bovino, gerando uma MEC descelularizada não tóxica para as células ovarianas e conserva as moléculas da MEC descelularizada o mais semelhante possível à MEC nativas.

Os primeiros estudos com estimulação e produção in vitro de embriões em bezerras pré-púberes foram realizados na década de 1990. Como naquela época não era possível predizer o valor genético de um animal antes do início da vida produtiva, o tema recebeu pouca atenção. Com o advento dos marcadores genéticos e a evolução na eficiência da Produção in vitro de Embriões (PIVE) esse tema voltou a ser alvo de estudos. O objetivo desse trabalho foi avaliar uma molécula de hormônio folículo estimulante recombinante humano (rhFSH) de longa ação, a corifolitropina-alfa, em bezerras da raça Nelore (Bos taurus indicus) e novilhas prépúberes utilizada em um programa de PIVE. O presente experimento envolveu três etapas, objetivando estabelecer o protocolo a ser utilizado para a administração do rhFSH, e avaliar a pré-estimulação com rhFSH antes da aspiração folicular (OPU) em bezerras e em novilhas pré-púberes. Foi realizado um ensaio preliminar de resposta para definir a dose a ser utilizada (10 mcg). Em seguida, bezerrasforam alocadas aleatoriamente para receber rhFSH por via SC (n=5) ou IM (n=5). O desenvolvimento folicular ovariano foi monitorado diariamente por ultrassonografia por cinco dias. Em ambos os grupos o diâmetro médio do folículo aumentou (P<0,0001) de 0h a 96h após o tratamento, estabilizando-se a partir de então. Em um segundo momento, já com a dose e via de aplicação já definidas, o protocolo foi utilizado em programas de PIVE em fazendas comerciais. No experimento 2, bezerras (n=90) foram distribuídos aleatoriamente em 5 grupos: 1) GC: bezerras sem pré-estimulação; 2) rhFSH-96h: rhFSH SC e OPU 96h depois; 3) rhFSH-120h: rhFSH SC e OPU 120h depois; 4) eCG-96h: 300 UI eCG IM e OPU 96h depois; e 5) eCG-120h: 300 UI eCG IM e OPU 120h depois. Vacas nelore (n=10) foram utilizadas como referência para os resultados do PIVE. O pré-tratamento com rhFSH aumentou a proporção de complexos cumulus-oócitos (COC) grau I em comparação com eCG ou controles (P<0,0001), e no rhFSH-120h a taxa de blastocisto foi semelhante à de vacas maduras (P>0,05). No entanto, rhFSH aumentou a proporção de COC expandidos e diminuiu a proporção de COC viáveis (P<0,0001). No Experimento 3, novilhas pré-púberes (n=60) foram tratadas ou não (grupo controle) com rhFSH, e a OPU foi realizada 72 ou 96 horas depois. O intervalo entre o tratamento e a aspiração do folículo não afetou nenhum parâmetro analisado. Novilhas pré-tratadas com rhFSH apresentaram maior proporção de COC grau I (P=0,0188) e taxa de blastocisto (P<0,0098). No entanto, este grupo apresentou menor nümero de COC viáveis (P=0,0264), resultando em quantidade semelhante (P=0,5869) de embriões produzidos por doadora/OPU. A taxa de prenhez também foi semelhante entre os grupos controle e rhFSH (19,3 vs. 25,0%, P=0,4142). Em resumo, o tratamento com uma única injeção SC de corifolitropina-alfa foi eficaz para promover a superestimulação em bezerros. No entanto, os potenciais benefícios dos protocolos préestimulatórios usando rhFSH foram compensados por uma diminuição no número total de COC viáveis recuperados, não aumentando o número de embriões produzidos por doadora/OPU.

A criopreservação de sêmen é uma técnica de grande impacto utilizada na produção animal. Apesar de bem estabelecida em algumas espécies, a resposta à criopreservação e a capacidade de produzir embriões in vitro varia de indivíduo para indivíduo. Assim, a identificação de um marcador que possa indicar a congelabilidade e fecundidade da amostra, antes do congelamento, seria de grande valia para a indústria de sêmen. Buscando uma nova avaliação que possa predizer a qualidade espermática pós-descongelamento, este estudo avaliou a quantidade de DNA livre de células e o número de cópias de mtDNA no plasma seminal de touros Nelore. O sêmen de nove touros foi coletado por eletroejaculação, metade do ejaculado foi utilizado para avaliação do sêmen fresco e obtenção do plasma seminal para quantificação de cfDNA, a outra metade foi criopreservada. A avaliação de movimento espermático pelo CASA (IVOS 12.3/Hamilton-Thorne, EUA) e da integridade e estabilidade da membrana plasmática, integridade acrossomal, apoptose e potencial mitocondrial, por citometria de fluxo, (AMNIS FlowSight - Amnis Corp., EUA) foram realizados no sêmen fresco e sêmen congelado/descongelado às 0, 3, 6 e 12h após o descongelamento. O sêmen criopreservado também foi utilizado para a produção de embriões in vitro. A quantificação de cfDNA foi realizada por espectrofotometria e o número de cópias do mtDNA foi quantificado por qPCR. A concentração de cfDNA presente no plasma seminal variou de 15,23 ng/μL a 519,71 ng/μL. A mediana foi calculada (58,95) e dois grupos foram definidos de acordo com a concentração de cfDNA: LowcfDNA (<58,95 ng/μL; n=5) e HighcfDNA (>58,95 ng/μL; n=4). O número de cópias de mtDNA foi semelhante (P>0,05) entre os grupos. No sêmen fresco, a porcentagem de células com estabilidade de membrana foi maior (P<0,05) no grupo LowcfDNA (84,24%) comparado ao grupo HighcfDNA (52,72%) e, ao longo de 12 horas pósdescongelamento, não houve diferenças para todos os parâmetros avaliados entre os grupos. A taxa de clivagem e de blastocistos em D7 foi maior para o grupo HighcfDNA (60.74% ± 3.38 e 24.95% ± 2.56, respectivamente), do que para o grupo LowcfDNA (41.21% ± 3.23 e 6.42 ± 1.14). O grupo HighcfDNA também produziu embriões de melhor qualidade. A concentração de cfDNA no plasma seminal não é capaz de predizer a congelabilidade do sêmen, mas animais com maior quantidade de cfDNA são capazes de produzir in vitro mais embriões e de melhor qualidade.

Este estudo teve como objetivo avaliar características bioquímicas do ambiente folicular na capacidade do ovócito de formar embrião e identificar marcadores para selecionar ovócitos mais competentes. Inicialmente foi avaliado se a fonte proteica (FP) utilizada durante a maturação in vitro (MIV) afetariam o sexo / desenvolvimento do embrião e o perfil de expressão de genes candidatos nas CC. Ovócitos bovinosforam maturados e cultivados na presença de soro fetal bovino (SFB) ou albumina sérica bovina (BSA), biopsias de CC foram removidas antes e após a MIV, e após a fecundação e o cultivo, as CCsforam agrupadas de acordo com seu resultado em: CCs de CCOs imaturos e CCs de CCOs maturados que resultaram ou não em embriões. O efeito da FP durante a MIV foi determinado pela quantificação de transcritos dos genes, GPC4, VCAN, GHR, PTGS2 e ALCAM. Os resultados mostraram que a FP afeta a produção de embriões se o SFB for usado tanto na MIV quanto no CIV. No entanto, quando o embrião é cultivado em BSA, a FP durante a MIV não tem nenhum efeito. Além disso, a FP durante a MIV afeta a expressão dos genes VCAN, GHR, PTGS2 e ALCAM nas CCs, e apenas o gene GHR foi expresso de forma diferente (P <0,05) em CC imaturas do grupo que deu embrião, mas apenas quando SFB foi usado na MIV. Na segunda parte do estudo características bioquímicas do ambiente folicular que contêm ovócitos capazes ou não de formar embrião. Folículos de 5-6mm foram dissecados e de cada folículo foram coletados individualmente amostras de líquido folicular (LF), células da granulosa (CG), CC imaturas e maturadas, e os CCOs foram utilizados para a produção de embriões. No D8 de acordo com o resultado as amostras foram agrupadas em: as que os ovócitos originaram embrião (EMB) e as que não originaram (NEMB). Nas CC imaturas e maturas e CGs foi analisada por qPCR a expressão de 8 genes: CASP3, SERPINE2, VCAN, LUM, FSHR, EGFR, PGR e GHR. E no LF foi avaliado DNA livre de células (cfDNA), por quantificação das sequencias de ART2 e BOVTA por qPCR e a concentração de progesterona e estradiol por quimiluminescência e eletroquimioluminescência, respectivamente. Dos 8 genes avaliados, o gene GHR apresentou maior quantidade de transcritos em CC imaturas de CCOs do grupo EMB, CASP3 apresentou maior expressão em CC maturas do grupo NEMB, e os genes CASP3 e GHR apresentaram aumento no nível de transcritos durante a MIV apenas no grupo NEMB, já o gene VCAN apresentou aumento durante a MIV nas CC do grupo EMB. As análises das amostras de LF, mostraram maior quantidade (P<0.05) de cfDNA somente do gene ART2 no LF do grupo NEMB comparado ao EMB. A concentração de progesterona no LF foi similar entre os grupos, enquanto a de estradiol foi maior (P<0,05) no grupo EMB, consequentemente maior relação P4/E2 foi encontrada no grupo EMB (P<0,05). Conclui-se que, que a FP durante a MIV pode afetar a expressão de genes candidatos. E, que maior nível de transcritos de GHR em CC imaturas, a menor expressão de CASP3 em CC maturas, a alto nível do gene ART2, a concentração de Estradiol e a relação de P4/E2 no LF podem indicar ovócitos com maior potencial de desenvolvimento.