As bactérias aeróbias formadoras de endósporos (Bafes) são microrganismos grampositivos que possuem um baixo teor de guanina-citosina em seu material genético. São capazes de formar o esporo como estratégia de sobrevivência quando se deparam com condições ambientais desfavoráveis. O esporo consiste na unidade celular vegetativa, com metabolismo reprimido e com maior resistência à temperatura, radiações, agentes químicos e predação de organismos superiores. As Bafes possuem diversas aplicabilidades biotecnológicas: estão presentes na produção de bioinseticidas, detergentes, materiais têxteis, biocombustíveis e na biorremediação de metais pesados. A biorremediação traduz-se por remoção, transformação ou redução de agentes poluentes do meio ambiente, como o petróleo. O petróleo consiste em uma mistura complexa de hidrocarbonetos que é utilizado principalmente como combustível e, devido à alta demanda, são frequentes os acidentes petrolíferos que contaminam solos e mares, que perturbam o ciclo de vida desses ecossistemas. Diante desse cenário, encontrar bactérias que sejam capazes de biodegradar o petróleo e óleo diesel é importante para a construção de um sistema biorremediador eficaz. O objetivo deste trabalho foi selecionar Bafes que fossem capazes de utilizar hidrocarbonetos para obtenção de energia quando ofertados petróleo e óleo diesel S10 como única fonte de carbono. As bactérias utilizadas nesse estudo são Bafes isoladas do solo do Distrito Federal (SDF) que fazem parte do acervo da coleção CBafes do Laboratório de Microbiologia/ LaBafes da Universidade de Brasília. Foram selecionadas 50 linhagens SDF para cultivo. Após a primeira triagem, foram cultivadas 46 linhagens SDF em meio mineral sólido suplementado e óleo diesel como única fonte de carbono. De 46, 9 linhagens apresentaram crescimento em óleo diesel S10 e 5 linhagens foram capazes de crescer no meio contendo petróleo. Foram escolhidas duas linhagens que apresentaram maior crescimento nos meios utilizados e performado testes de quantificação de proteínas totais intracelulares e secretadas, teste qualitativo do consumo bacteriano de petróleo, testes da capacidade de produção de lipases e de biossurfactantes e da habilidade de adesão à hidrocarbonetos. Foram observadas diferenças em relação à concentração de proteínas nos diferentes meios testados, assim como diferenças entre proteínas intracelulares e secretadas. Foi constatada a ausência da formação de biossurfactantes, o que motivou a busca de outro teste que pudesse evidenciar o artifício utilizando pelas linhagens para o contato entre o óleo e a célula, confirmado pelo teste de adesão das linhagens ao óleo diesel. A robusta e extensiva busca por bactérias degradadoras de óleo diesel e petróleo, assim como seus estudos preliminares, proporcionam diversas possibilidades promissoras para pesquisas mais aprofundadas acerca de microrganismos biorremediadores de petróleo e derivados.

Os fosfolipídios são moléculas fundamentais para a estrutura e função da membrana plasmática de células eucarióticas e procarióticas, além de estarem envolvidos no processo de adaptação ao meio ambiente e sinalização celular. Atualmente, diversos estudos exploram as vias de biossíntese de fosfolipídios como potencial alvo terapêutico contra fungos patogênicos, sendo assim, esse estudo teve por objetivo investigar o papel das vias de biossíntese de fosfatidilcolina na virulência do fungo Cryptococcus neoformans, através da construção e caracterização de mutantes knockout para os genes que codificam enzimas putativas de duas vias biossintéticas desse fosfolipídio. Os mutantes foram obtidos através de técnicas moleculares de deleção gênica por Double Joint-Polymerase Chain Reaction (DJ-PCR) e biobalística, e submetidos a testes fenotípicos para avaliar diferentes atributos associados à sua virulência. O mutante do gene OPI3, da via de novo, possui crescimento significativamente afetado na ausência de colina no meio de cultura, enquanto o duplo mutante opi3Δpct1Δ para as duas vias consegue crescer apenas na presença de extrato de levedura, ou em ágar gema de ovo. Ambos os mutantes induzem cápsulas polissacarídicas maiores que o selvagem KN99α, enquanto em testes de suceptibilidade a antifúngicos, o mutante do gene PCT1, da via alternativa Kennedy, apresentou maior suscetibilidade aos antifúngicos da classe dos azóis, como fluconazol e itraconazol. Os resultados indicam que essas vias estão associadas com outros mecanismos celulares, além da manutenção da integridade da membrana plasmática.

Neste trabalho foram estudados os microrganismos já descritos como degradadores de polietileno, os quais foram isolados a partir de resíduos plásticos encontrados em solos do Cerrado por PEIXOTO, 2018 - Comamonas sp., Delftia sp., e Stenotrophomonas sp. O presente estudo consistiu na descrição taxonômica e fenotípica de uma das bactérias, além da caracterização de uma proteína isolada de Delftia sp. Com base na estruturação proposta neste documento, o primeiro capítulo apresenta uma introdução, no qual se justifica a escolha do microrganismo para caracterização taxonômica, para tanto utilizou-se as ferramentas ANI e dDDH, e a seleção da enzima definida para caracterização funcional selecionada a partir de dados genômico e transcritômicos do microrganismo cultivado com polietileno. O segundo capítulo, por sua vez, descreve a caracterização taxonômica da linhagem Comamonas sp. PE 63. A classificação taxonômica baseada na análise do genoma confirmou o potencial de essa estirpe consistir em uma nova espécie dentro do seu gênero, apresentando como vizinho filogenético mais próximo a C. testosteroni ATCC 11996, com dDDH de 48,6% e ANI < 93%. A análise do perfil de ácidos graxos revelou as distinções entre a PE 63 e a ATCC 11996. Além disso, foram realizadas análises comparativas de pangenoma, predição de genes e caracterização fenotípica in silico, complementando o estudo taxonômico e filogenético da Comamonas sp. PE 63. O terceiro e último capítulo descreve a caracterização bioquímica de uma peroxirredoxina produzida pelo isolado Delftia sp. PE 138. A proteína foi selecionada com base em dados de expressão diferencial durante o cultivo de Delftia sp. com polietileno como única doente de carbono. Para tanto, realizou-se a expressão heteróloga e a purificação da peroxirredoxina. Os resultados bioquímicos indicaram que a proteína é estável em uma ampla faixa de temperatura (10 a 45 °C) e que o pH ótimo de atividade é 7. Além disso, a proteína apresentou estabilidade durante sete dias quando incubada a 30 °C. Por meio de técnicas computacionais, a estrutura tridimensional dessa proteína foi prevista e validada. Os efeitos da temperatura, pH e tratamento com DTT e H2O2 nas estruturas secundárias da proteína foram inferidos por meio da técnica de dicroísmo circular. Os resultados obtidos nesse trabalho auxiliam no direcionamento de novas pesquisas no estudo de gestão de resíduos plásticos, visto que uma bactéria não descrita anteriormente e com potencial para degradação de plásticos foi caracterizada, bem como uma enzima com possível influência na biodegradação.

Organismos halófilos crescem em ambientes com altas concentrações de sais e estão distribuídos nos três domínios da vida: Bacteria, Eukarya e Archaea. Tais ambientes incluem águas salgadas, solos, alimentos salgados fermentados e sais alimentares. A presença de procariotos halófilos em sais alimentares é comum e foi descrita em vários trabalhos científicos, no entanto, não há informações sobre sua ocorrência em sais comercializados no Brasil. Assim, este trabalho teve como objetivo principal a caracterização de procariotos halófilos extremos presentes em sais alimentares, inicialmente por meio de abordagens dependentes de cultivo. Alíquotas de quatro sais comerciais foram inoculadas em dois meios de cultura para halófilos (ATCC e MGM), adicionados de 3 ou 4 M de NaCl, na busca de organismos halófilos extremos. Os resultados obtidos sugerem a presença tanto de bactérias como de archaeas nos sais analisados, uma vez que foi observado o crescimento microbiano em todos os meios analisados. Em sua grande maioria, as colônias obtidas apresentavam coloração avermelhada, típica de archaeas halófilas, enquanto a análise microscópica revelou a presença tanto de cocos como bacilos, predominantemente Gram negativos. Todas as culturas foram submetidas à extração de DNA, seguida de PCR, com iniciadores específicos para Archaea e Bacteria. Amplicons obtidos a partir de alguns dos sais foram então ligados a vetores de clonagem e transformados em células de Escherichia coli XL1-Blue. Clones recombinantes foram analisados por sequenciamento de DNA e os resultados revelam a presença de archaeas cujos genes de rRNA 16S exibem elevado grau de identidade com os respectivos genes das archaeas dos gêneros Halobacterium e Halolamina

Infecções no trato urinário (ITUs) são a causa mais frequente de infecções bacterianas em seres humanos. Estima-se que a cada ano, aproximadamente 150 milhões de pessoas são acometidas por essa patologia em todo o mundo. Responsável por 80%-90% dos casos, a enterobactéria Gram-negativa conhecida como Escherichia coli uropatogênica (Uropathogenic Escherichia coli – UPEC), é o agente causador mais comum de ITUs adquiridas na comunidade. A capacidade de UPEC em sobreviver no trato urinário depende tanto de sua fisiologia e metabolismo quanto de seus determinantes de virulência. Recentemente, foi demonstrado que há uma ligação entre o transporte e o metabolismo de vários carboidratos e a virulência em enterobactérias. Todavia, como o papel preciso da utilização de carboidratos na expressão e regulação da virulência bacteriana ainda não foi determinado, buscamos compreender o impacto que o metabolismo de diferentes fontes de carbono tem sobre a expressão de fatores de aptidão e virulência na patogênese de UPECs resistentes à múltiplas drogas (MDR), com ênfase na expressão das fímbrias tipo 1. O objetivo deste trabalho é compreender o efeito que o uso de diferentes fontes de carbono tem sobre a expressão de genes e mecanismos de virulência de linhagens UPECs MDR. Para este fim, quatro linhagens diferentes de UPECs MDR (representantes do grupo A, B1, B2 e D) foram submetidas a determinação do perfil de resistência aos antibióticos, a análise da capacidade de sobrevivência e reprodução (fitness bacteriano), de expressar fímbrias tipo 1 funcionais, de formar biofilme utilizando diferentes fontes de carbono e de sobreviver em sangue e soro. Em condições anaeróbicas semelhantes a encontrada ao longo do trato urinário, todas as UPECs analisadas utilizaram D-(-)-Sorbitol como fonte de carbono de alto rendimento. Três das quatro estirpes analisadas não utilizam D-(-)-Frutose como fonte de carbono para seu crescimento. Os dados obtidos através do Ensaio de Aglutinação de Levedura sugerem que o metabolismo de D-(-)-Frutose tem relação com a expressão de fímbrias tipo 1 funcionais na superfície celular de três das quatro estirpes analisadas. UPEC 76 não utilizou D-(-)-Frutose como fonte de carbono para seu crescimento ou para expressar fímbrias tipo 1 funcionais. Todas as UPECs analisadas são classificadas como produtoras moderadas de biofilme quando crescidas em N-acetil-D-glicosamina. Três das quatro estirpes apresentaram uma capacidade aumentada de sobreviver em sangue e soro ao utilizar N-acetil-D-glicosamina como fonte única de carbono. Em conjunto, nossos dados sugerem que o metabolismo de diferentes fontes de carbono (açúcares) modulam a expressão de fatores de virulência como o crescimento exarcebado, a expressão de fímbrias tipo 1 funcionais e a resistência ao soro em diferentes estirpes de Escherichia coli uropatogênica resistentes à múltiplas drogas de origem clínica.

Corynebacterium glutamicum é uma bactéria não patogênica amplamente utilizada na produção industrial de aminoácidos, moléculas que se encontram em terceiro lugar no mundo entre as mais produzidas por meio da fermentação, atingindo milhões de toneladas e com números crescentes no mercado mundial. C. glutamicum tem sido amplamente estudada, uma vez que os métodos tradicionais utilizados para produção de aminoácidos demandam um alto custo com isso, alternativas estão sendo buscadas a fim de baratear a produção e aumentar a produtividade. Nesse contexto, a proteômica tem desenvolvido papel fundamental para compreender e melhorar a eficiência de produção de aminoácidos, visto que o entendimento das vias de biossíntese depende da interpretação de análises proteômicas. Isso porque com a proteômica existe possibilidade de descrição e caracterização do funcionamento das vias metabólicas, sendo capaz de identificar modificações pós-traducionais (PTMs), além de ser apta para identificar a degradação de proteínas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo geral identificar e caracterizar proteínas e complexos proteicos que participam das vias da biossíntese de aminoácidos dessa bactéria, com a influência de Tween 40 para produção de glutamato, por meio da abordagem proteômica de espectrometria de massas bottom-up, analisando o perfil proteico intracelular e extracelular. A análise de aminoácidos secretados pelo microrganismo resultou, no tempo de 18h de cultivo, a concentração de glutamato de 0,70 ± 0,14 mM na condição tween 40, enquanto na condição controle foi de 0,04 ± 0,02 mM (Teste t p<0,05). Os complexos proteicos foram separados via eletroforese BN-PAGE, apresentando complexos proteicos intracelulares variando entre 20kDa e 720kDa. Foram identificadas proteínas importantes para o metabolismo da C. glutamicum , como a enolase e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase , pertencentes a via glicolítica e a glutamina-sintetase, envolvida na biossíntese de glutamato. A análise do perfil proteico extracelular por SDS-PAGE apresentou proteínas entre 10 a 80 kDa, sugerindo diferença na abundância de algumas proteínas entre as condições. Na análise, bottom-up por LCMS/MS do secretoma, foi possível identificar algumas protéinas reguladas mais abundantes na condição com tween 40, como 2-oxoglutarato desidrogenase que é precursor da síntese de L-Glutamato. Tais resultados possibilitam a melhor compreensão do maquinário bioquímico envolvido na produção e secreção de aminoácidos por Corynebacterium glutamicum e, ajudar no aperfeiçoamento da sua manipulação científica em direção aos interesses biotecnológicos.

A demanda global de energia e a preocupação com o desenvolvimento de uma economia sustentável têm incitado a busca por processos para a obtenção de compostos químicos com potencial para substituir, ao menos em parte, os oriundos de fontes fósseis não renováveis. Nesse contexto, a biomassa lignocelulósica apresenta grande potencial como matéria-prima alternativa e renovável para a produção de compostos de alto valor agregado através de bioprocessos. Um dos principais desafios nesses processos refere-se à presença de inibidores no hidrolisado lignocelulósico, os quais são formados ou liberados durante as etapas de pré-tratamento e hidrólise da biomassa. São compostos que podem inibir o metabolismo microbiano e, consequentemente, o rendimento e produtividade dos bioprocessos. Os inibidores estão reunidos em 3 grupos principais: ácidos orgânicos (p. ex. ácidos acético, fórmico e levulínico), furaldeídos (furfural e 5- hidroximetil-2-furaldeído) e compostos fenólicos. Estudos anteriores demonstram o potencial da levedura Komagataella phaffii de manter-se ativa na presença desses inibidores. Assim, análises fisiológicas e transcriptômicas de K. phaffii revelaram genes com potencial para aumentar a tolerância da levedura a furaldeídos, ácido acético e hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar. Esse trabalho objetiva a validação da expressão de cinco genes putativos - YJR096W, YDL124W, SAP30, FLR1 e 2661 – na resposta de K. phaffii M12 na presença de diferentes inibidores, em diferentes condições de cultivos fermentativos. Inicialmente, cada um dos genes foi amplificado por PCR e clonado no vetor de clonagem pGEM®-T Easy. Para clonagem no vetor de expressão pKLD, sob controle do promotor PGK1, empregou-se os sítios de clonagem BamHI/NotI e BcuI. Até então, linhagens de K. phaffii expressando o gene YJR096W foram construídas com sucesso. Ensaios em microplaca e frasco Erlenmeyer foram realizados para avaliar as respostas da linhagem recombinante aos inibidores furfural, HMF e hidrolisado lignocelulósico. A linhagem controle e a recombinante demonstraram os mesmos perfis de crescimento, consumo de substrato e formação de produtos na presença de HMF 2 g/L, furfural 3 g/L e hidrolisado lignocelulósico 30%. Assim, nas condições de cultivo avaliadas até então, a superexpressão do gene YJR096W, em K. phaffii M12, não resultou em aumento de tolerância à presença dos inibidores furfural, HMF e hidrolisado lignocelulósico. As próximas etapas envolvem a superexpressão dos demais genes e validação das linhagens recombinantes.

A resistência antimicrobiana (RAM) acontece quando bactérias não respondem às terapias ofertadas tornando as infecções mais difíceis de serem tratadas podendo levar à morte do paciente. Serratia marcescens é uma enterobactéria responsável por causar infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) e, frequentemente, apresentam RAM. Esta espécie é considerada um agente causador de infecções oportunistas de tratamentos desafiadores devido à presença de vários tipos de mecanismos promotores de RAM. Neste contexto, é fundamental que se amplie o estudo dos mecanismos de disseminação de RAM visando o diagnóstico rápido e preciso, além do rastreamento epidemiológico para interromper a cadeia de transmissão de RAM dentro do ambiente. No presente trabalho, Quatro (4) isolados de Serratia marcescens causadores de bacteremia em pacientes internos em uma Unidade de Terapia Intensiva (UTI) foram submetidos à determinação do perfil de susceptibilidade antimicrobiana e de epidemiologia molecular. A determinação do perfil de susceptibilidade antimicrobiana foi determinada por testes fenotípicos (antibiograma por métodos automatizados, disco difusão e imunocromatografia), genotípico para a detecção de beta-lactamases (PCR) e por genômica (sequenciamento WGS). O delineamento da cadeia de transmissão dos isolados foi determinado por epidemiologia molecular através da análise de fingerprinting de sequencias repetitivas intergênicas para enterobactérias (ERIC-PCR) e por pangenoma. As análises fenotípicas e de genômica para não susceptibilidade demonstram que todos os isolados se apresentaram resistentes a todos antimicrobianos disponíveis sendo classificados como pan-resistentes (PDR). A imunocromatografia identificou as carbapenemases KPC e NDM em todos os isolados, contudo a genotipagem por PCR identificou KPC apenas em 2 isolados e a genômica não identificou a enzima em nenhum deles. As análises de similaridade genética por ERIC-PCR e pangenomica determinou que os isolados se apresentaram filogeneticamente idênticos e, portanto, clonais. Em sua totalidade os resultados indicam que análises genômicas por WGS são ferramentas precisas e robustas para o diagnóstico de RAM, contudo a mesma deve ser realizada imediatamente após o isolamento bacteriano para evitar diagnósticos imprecisos devido a perdas de elementos genéticos instáveis, como no caso de blaKPC que codifica a enzima KPC. A análise de pan-genoma, também, demonstrou-se precisa para a identificação de clones bacterianos entre os isolados, além de possibilitar identificar a presença de clones de disseminação mundial.

O estudo de virus é de extrema importância para a sociedade, pois compreende o estudo organismos responsáveis por causar inúmeras doenças. O monitoramento regular de vírus isolados de culturas é muito importante com relação a virologia de plantas. A identificação rápida e precisa de vírus potencialmente perigosos pode prevenir surtos graves em culturas de importância econômica. Atualmente, as tecnologias de High Throughput Sequencing (HTS) tornaram-se uma ferramenta acessível e poderosa para essa finalidade. Neste estudo, avaliamos o uso de amostras de águas residuais para monitorar vírus de plantas usando análise HTS e RT-qPCR. Vírus de plantas pertencentes a 12 famílias de vírus foram encontrados, dos quais Virgaviridae, Solemoviridae, Tymoviridae, Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae, Closteroviridae e Secoviridae foram os mais abundantes com mais de 20 espécies. Além disso, um virus quarentenário e uma nova espécie de tobamovírus também foram descobertos. Também foi analisada a relevancia de alimentos processados como fonte desses virus em águas residuais. O Pepper tobamo mild mottle virus (PMMoV) foi detectada em abundância em amostras de alimentos processados à base de pimenta e amostras de esgoto, e o Common garlic latent carlavirus (GarCLV) foi detectado em menor quantidade em amostras de alho seco e fresco e amostras de esgoto. Isso mostrou uma alta correlação entre a abundância viral no esgoto e nas fontes de alimentos processados. O uso potencial de águas residuais para pesquisa de vírus é discutido neste estudo. Além do monitoramento de virus, também é de grande importância o estudo de virus já conhecidos que também podem ter importância econômica não apenas no quesito fitossanitário, mas também tecnológico como o uso de vetores de expressão. O pepper ringpot virus (PepRSV) até o momento é o único tobravírus relatado no Brasil. Ele vem sendo usado como vetor viral para produção de proteínas recombinantes. Porém, por ser um virus restrito ao Brasil, ainda é um virus pouco estudado quando comparada a outras espécies também utilizadas para este fim. Este trabalho também apresenta como objetivo o estudo de uma putativa nova ORF N1 do PepRSV, para isso construções mutantes da ORF N1 foram agroinfiltradas em folhas de Nicotiana benthamiana e sua localização intracelular, a partir da fusão da proteína com proteínas de florescência para serem observadas por microscópio confocal. Com as construções mutantes podemos observar sintomas distintos como a ativação de lesões locais, murcha e tombamento, antes não verificados nos clones infecciosos originais. ORFN1/GFP mostrou localização associada ao reticulo endoplasmático.

A biomassa lignocelulósica é a matéria-prima renovável mais abundante no planeta e o seu máximo aproveitamento é fundamental para uma economia mais sustentável. Entre os desafios da sua utilização por microrganismos, estão a eficiente assimilação dos açúcares que a compõem e a tolerância desses organismos aos compostos inibitórios derivados das etapas de pré-tratamento e hidrólise da lignocelulose. Entre eles, o ácido acético é o principal ácido liberado durante a despolimerização da lignocelulose e exerce forte efeito inibitório ao crescimento microbiano, consequentemente comprometendo seu metabolismo e a produção de compostos de interesse. O fator de transcrição Haa1 previamente descrito em Saccharomyces cerevisiae é o principal regulador da resposta celular ao estresse fisiológico causado pela presença de ácido acético e a sua superexpressão apresenta potencial para favorecer o desempenho de outras leveduras na presença desse inibidor. Neste trabalho, o desempenho de linhagens recombinantes de Komagataella phaffii superexpressando o fator de transcrição Haa1 homólogo foi avaliado na presença de ácido acético e hidrolisado lignocelulósico. Adicionalmente, também foi avaliado o efeito da superexpressão de Haa1 sobre a produção de ácido xilônico por K. phaffii. A superexpressão de Haa1 conferiu à levedura maior tolerância ao ácido acético entre 4 g·L-1 e 6 g·L-1 reduzindo o tempo de destoxificação em até 12 horas e aumentando a produção de biomassa da levedura em até 37%. O efeito da superexpressão de Haa1 não demostrou, no entanto, efeito significativo na produção de ácido xilônico por K. phaffii quando essa foi cultivada em batelada alimentada com glicose e xilose. Os resultados obtidos demonstram a eficiência de Haa1 no aumento da tolerância a ácido acético e abrem caminho para melhorar o desempenho da levedura na produção de ácido xilônico.